王玉珍 謝基明 王寧飛 劉 帥 (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,呼和浩特010018)

Rab GTPases(Ras-related proteins in brain)是Ras超家族中的一類(lèi)GTP酶。一些Rab蛋白在從酵母到人類(lèi)的進(jìn)化過(guò)程中高度保守[1]。Rab蛋白調(diào)控著囊泡的出芽、形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、錨定和融合等過(guò)程[2]。Rab GTPases能夠在GTP結(jié)合的活性形式和GDP結(jié)合的非活性形式之間轉(zhuǎn)換。在GTP結(jié)合的活性形式,GTPases與下游的效應(yīng)分子相互作用,共同調(diào)節(jié)了囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的各個(gè)環(huán)節(jié)[3]。

Rab GTPase 7(Rab7)定位于晚期內(nèi)體/溶酶體結(jié)構(gòu),調(diào)控著囊泡運(yùn)輸?shù)耐砥谶^(guò)程[4]。近年來(lái)的研究表明,Rab7通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)受體蛋白廣泛地參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。Rab7參與轉(zhuǎn)運(yùn)血管緊張素II受體 1A(AT1AR)、EGFR、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrKA到溶酶體降解[5-7]。Rab7與Toll-like receptors(TLRs)的關(guān)系如何,報(bào)道甚少。

多聚肌苷酸poly I:C(polyinosinic-polycytidylic acid)是一種人工合成的模擬病毒RNA的雙鏈RNA(dsRNA),誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生Ⅰ型干擾素,類(lèi)似于病毒感染后效應(yīng)[8]。poly I:C誘導(dǎo)的活化效應(yīng)是通過(guò)Toll-like receptor 3(TLR3)來(lái)介導(dǎo)的[9]。TLRs是一類(lèi)模式識(shí)別受體,通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)的分子模式,啟動(dòng)免疫應(yīng)答。盡管TLRs信號(hào)的充分活化對(duì)于清除入侵的病原體必不可少,但是TLRs的過(guò)度活化可能促進(jìn)免疫病理性疾病的發(fā)生[10],因此負(fù)向調(diào)節(jié)TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

在TLRs的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中,TLR3活化免疫細(xì)胞是通過(guò)胞內(nèi)的接頭蛋白TRIF促進(jìn)前炎癥因子以及IFN-α/β的產(chǎn)生[11]。負(fù)向調(diào)節(jié)TLR3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而抑制前炎癥因子以及IFN-α/β的產(chǎn)生對(duì)于防治自身免疫性疾病具有積極的意義。

在本實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)構(gòu)建Rab7的失活突變載體,研究Rab7失活突變后對(duì)poly I:C激活的巨噬細(xì)胞RAW264.7中前炎癥因子以及IFN-β的影響。該實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究Rab7對(duì)TLR3信號(hào)通路的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7來(lái)自于ATCC;胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;poly I:C購(gòu)自Sigma公司;TRIZOL、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq酶,real-time PCR mix均為寶生物公司產(chǎn)品;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司;Rab7抗體、actin抗體均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。

1.2 突變載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的野生型Rab7真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Rab7經(jīng)過(guò)PCR定點(diǎn)突變將Rab7蛋白序列中GKT/S結(jié)構(gòu)域22位的T(蘇氨酸)突變?yōu)镹(天冬氨酸)。該突變載體記為pcDNA3.1-tRab7。這種突變使Rab7與GTP的結(jié)合能力下降,表現(xiàn)為功能顯性失活[12]。突變導(dǎo)入引物為:sence5′-GGT GTT GGA AAG AAC TCT CTC-3′和 antisence 5′-GTT GGGGGCAGT CACATC-3′。PCR 反應(yīng)條件為:94℃變性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸5分鐘,30個(gè)循環(huán),后續(xù)的PCR產(chǎn)物酶切、連接反應(yīng)和細(xì)菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序鑒定。

1.3 小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7的培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 RAW264.7細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1～2天換液或傳代一次。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí),將適量的RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿中(24孔板:2×105;6孔板:4×105),37℃培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞密度達(dá)到近90%時(shí),進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染方法參照脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后40小時(shí),采用poly I:C(10μg/ml)進(jìn)行刺激。

1.4 總RNA提取及定量分析 總RNA采用TRIZOL試劑根據(jù)說(shuō)明進(jìn)行提取。RT-PCR和 real-time PCR 使用的 引 物 序列 為:IFN-β:5′-CGTTCCTGCTGTGCTTCT-3′(sence)和 5′-GTCCGCCCTGTAGGTGAG-3′(antisence)。IP10:5′-TGCCGTCATTTTCTGCCT-3′(sense)和 5′-GGTCATCATTCTTTTTCATCGT-3′(antisence)。TNF-α:5′-ACT TGG TGG TTT GCT ACG-3′(sence)和5′-ACT GAA CTT CGG GGT GAT-3′(antisence)。 IL-1β:5′-TTG GGG TCC GTC AAC TTC-3′(sence)和 5′-CTA ATA GGCTCA TCTGGG-3′(antisence)。real-time PCR采用ABI 7300(Applied Biosystems,USA)and SYBR RT-PCR kit進(jìn)行檢測(cè)分析,計(jì)算方法采用2-ΔΔct法 。

1.5 Western blot檢測(cè) 2×105RAW264.7在密度達(dá)到90%時(shí)轉(zhuǎn)染1μg的 pcDNA3.1、pcDNA3.1/mRab7和pcDNA3.1/tRab7。轉(zhuǎn)染后48小時(shí),提取胞漿蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,等量的蛋白進(jìn)行SDSPAGE。蛋白隨后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜,采用Rab7的一抗和相應(yīng)二抗與膜孵育,ECL法檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)檢測(cè)actin的表達(dá)作為上樣一致的內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,P＜0.05時(shí)認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Rab7突變載體的構(gòu)建及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞后Rab7表達(dá) 我們將測(cè)序正確的Rab7真核表達(dá)載體采用定點(diǎn)突變法進(jìn)行Rab7突變質(zhì)粒的構(gòu)建。在圖1A的Rab7的蛋白序列中,GDSGVGKT是GTP酶家族保守的、與GTP結(jié)合的區(qū)域,其中該結(jié)構(gòu)域中的T(蘇氨酸)突變?yōu)镹(天冬氨酸)后,表現(xiàn)為與GTP結(jié)合能力下降的顯性失活形式。然后我們將突變質(zhì)粒 pcDNA3.1-tRab7及其對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后48小時(shí),檢測(cè)Rab7的表達(dá)。如圖1B所示,與對(duì)照組相比,野生型和突變Rab7質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后Rab7的蛋白水平都顯著增高,顯示出過(guò)表達(dá)狀態(tài)。

2.2 Rab7抑制了poly I:C誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá) 我們檢測(cè)了 Rab7過(guò)表達(dá)后對(duì) poly I:C刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞IFN-β的產(chǎn)生。如圖2A、B所示,Rab7過(guò)表達(dá)后顯著抑制了 IFN-β的表達(dá),Rab7突變后卻促進(jìn)了IFN-β的表達(dá),說(shuō)明Rab7 GTPase是以GTP結(jié)合的活性方式來(lái)發(fā)揮作用的。

2.3 Rab7抑制了poly I:C誘導(dǎo)的IP10的表達(dá) 我們檢測(cè)了Rab7過(guò)表達(dá)后對(duì)poly I:C刺激的RAW264.7細(xì)胞趨化因子IP10的表達(dá)。Rab7也是以依賴(lài)GTP結(jié)合活性的方式抑制了IP10的表達(dá)(圖3A、B)。

圖1 Rab7突變示意圖及Rab7的表達(dá)水平Fig.1 The diagram of Rab7 mutation and detection of Rab7 expression

圖2 Rab7抑制了RAW264.7細(xì)胞中poly I:C誘導(dǎo)的IFN-β表達(dá)Fig.2 Rab7 inhibited the expression of IFN-βin RAW264.7 after stimulation with poly I:C

圖3 Rab7抑制了RAW264.7細(xì)胞中poly I:C誘導(dǎo)的IP-10表達(dá)Fig.3 Rab7 inhibited the expression of IP10 in RAW264.7 after stimulation with poly I:C

圖4 Rab7抑制了RAW264.7細(xì)胞中poly I:C誘導(dǎo)的TNF-α和 IL-1βFig.4 Rab7 inhibited the expression of TNF-α和 IL-1β in RAW264.7 after stimulation with poly I:C

2.4 Rab7抑制了前炎癥因子TNF-α和IL-1β的表達(dá) 前面的研究結(jié)果顯示,Rab7能夠通過(guò)結(jié)合GTP的活性形式抑制poly I:C誘導(dǎo)的IFN-β和IP10的表達(dá)。這兩個(gè)細(xì)胞因子是受轉(zhuǎn)錄因子IRF3或IRF7調(diào)控,我們想進(jìn)一步探索,Rab7是否對(duì)poly I:C活化TLR3的信號(hào)通路中轉(zhuǎn)錄因子NF-кB調(diào)控的前炎癥因子的影響。如圖 4A、B所示,Rab7同樣抑制了TNF-α和 IL-1β的表達(dá)。與 IFN-β和 IP10的產(chǎn)生不同的是,Rab7突變后,IL-1β在poly I:C刺激24小時(shí)后表達(dá)最高。

3 討論

Rabs蛋白家族特征是具有與GDP/GTP的結(jié)合保守的“G domain”。在Rab7的相關(guān)研究中,Rab7的突變體Rab7T22N,即第22位的蘇氨酸(T)突變?yōu)樘於０?N),該突變體降低了與GDP/GTP的親和力,Rab7表現(xiàn)為功能喪失。Bucci Cecilia實(shí)驗(yàn)室的研究表明,野生型 Rab7能夠與 GTP結(jié)合,而突變體Rab7T22N不能與GTP結(jié)合,因此Rab7T22N被稱(chēng)為顯性失活體[12]。在我們的研究中,通過(guò)PCR定點(diǎn)突變法,也成功地將小鼠野生型Rab7(mRab7)突變?yōu)镽ab7T22N(tRab7),為后面的研究打下基礎(chǔ)。隨后,我們將突變質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,Western blot的結(jié)果顯示出過(guò)表達(dá)狀態(tài),說(shuō)明Rab7質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

近年來(lái),Rab7與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系是新的研究熱點(diǎn)。研究表明,PC12細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Rab7T22N后使神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrkA聚集在內(nèi)體,并促進(jìn)了NGF誘導(dǎo)的TrkA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),比如ERK1/2的磷酸化水平增高、神經(jīng)元生長(zhǎng)和GAP-43蛋白的表達(dá)[7]。然而關(guān)于Rab7與TLRs的轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究甚少。我們以前的研究結(jié)果表明,Rab7的同源分子Rab7b能夠通過(guò)轉(zhuǎn)運(yùn)TLR4受體到溶酶體降解從而負(fù)向調(diào)控了TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程[13]。而 Rab家族的Rab10能夠通過(guò)促進(jìn)TLR4轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜而促進(jìn)了TLR4的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]。我們的研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)Rab7能夠抑制poly I:C誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的表達(dá),該研究為Rab7與TLR3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)打下基礎(chǔ)。

TLR3通過(guò)接頭分子TRIF一方面會(huì)活化轉(zhuǎn)錄因子NF-kB調(diào)控前炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β等的釋放;另一方面會(huì)活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3,其主要調(diào)控Ⅰ型干擾素(IFN-α/β)的產(chǎn)生[15]。趨化因子IP10病毒感染時(shí)增高,其產(chǎn)生受IFN的調(diào)控。在我們的實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到,Rab7過(guò)表達(dá)后不僅抑制了IP10和IFN-β的表達(dá),也抑制了前炎癥因子 TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生。而 Rab7失活突變后逆轉(zhuǎn)了以上效應(yīng),說(shuō)明Rab7發(fā)揮作用依賴(lài)于其GTP結(jié)合活性。poly I:C是有效的病毒dsRNA的模擬劑,我們的結(jié)果提示Rab7可能與病毒逃逸機(jī)體的免疫反應(yīng)有關(guān),相關(guān)研究將會(huì)揭示病毒與免疫細(xì)胞的相互關(guān)系。

1 Pfeffer S.Filling the Rab GAP[J].Nature Cell Biology,2005;7:856-857.

2 Hutagalung A H,Novick P J.Role of Rab GTPases in membrane traffic and cell physiology[J].Physiol Rev,2011;91(1):119-149.

3 Barr F,Lambright DG.Rab GEFs and GAPs[J].Curr Opin Cell Biol,2010;22(4):461-470.

4 Wang T,Ming Z,Xiaochun W et al.Rab7:role of its protein interaction cascades in endo-lysosomal traffic[J].Cell Signal,2011;23(3):516-521.

5 Dale L B,Seachrist J L,Babwah A V et al.Regulation of angiotensin II type 1A receptor intracellular retention,degradation,and recycling by Rab5,Rab7,and Rab11 GTPases[J].J Biol Chem,2004;279(13):13110-13118.

6 Ceresa B P,Bahr SJ.Rab7 activity affects epidermal growth factor:epidermal growth factor receptor degradation by regulating endocytic trafficking from the late endosome[J].JBiol Chem,2006;281(2):1099-1106.

7 Saxena S,Bucci C,Weis J.The small GTPase Rab7 controls the endosomal trafficking and neuritogenic signaling of the nerve growth factor receptor TrkA[J].JNeurosci,2005;25(47):10930-10940.

8 Padalko E,Nuyens D,Palma A D et al.The interferon inducer ampligen[poly(I)-poly(C12U)]markedly protects mice against coxsackie B3 virus-induced myocarditis[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2004;48(1):267-274.

9 Kumar H,Kawai T,Akira S.Pathogen recognition in the innate immune response[J].Biochem J,2009;420(1):1-16.

10 Pasare C,Medzhitov R.Toll-like receptors:linking innate and adaptive immunity[J].Adv Exp Med Biol,2005;560:11-18.

11 Yamamoto M,Sato S,Hemmi H et al.Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent Toll-like receptor signaling pathway[J].Science,2003;301(5633):640-643.

12 Bucci C,Thomsen P,Nicoziani P et al.Rab7:akey to lysosomebiogenesis[J].Mol Biol Cell,2000;11(2):467-480.

13 Wang Y,Chen T,Cao X et al.Lysosome-associated small Rab GTPase Rab7b negatively regulates TLR4 signaling in macrophagesby promoting lysosomal degradation of TLR4[J].Blood,2007;110(3):962-971.

14 Wang D,Lou J,Ouyang C et al.Ras-related protein Rab10 facilitates TLR4 signaling by promoting replenishment of TLR4 onto the plasma membrane[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010;107(31):13806-13811.

15 Honda K,Taniguchi T.IRFs:master regulatorsof signalling by Toll-like receptors and cytosolic pattern-recognition receptors[J].Nat Rev Immunol,2006;6(9):644-658.