高 倩，李 娜，賈景明

(沈陽藥科大學(xué)，遼寧 沈陽 110016)

尼泊爾菊三七 Gynura nepalensis DC.為菊科菊三七屬植物，以地上部位入藥，為多年生草本植物，是我國最新發(fā)現(xiàn)的極具藥用價值的珍貴物種。該植物中含有大量具有藥理活性的生物堿、萜烯、苷類、黃酮、糖類、有機(jī)酸等化學(xué)成分[1]，其中黃酮類和多糖類成分具有明顯的降血糖作用。其主要分布在尼泊爾、緬甸、不丹、錫金和我國的貴州、云南等地，生長于海拔1100～2100 m的地區(qū)，見于溪邊巖石上和田邊[2]。由于其對氣候要求高，受繁殖方法和繁殖速度的影響，目前尚未人工引種栽培，而野生資源已遠(yuǎn)不能滿足市場需求。離體快繁技術(shù)通常包括4個環(huán)節(jié):無菌培養(yǎng)體系的建立，培養(yǎng)物的增殖，器官的分化，植株的生成和移栽[3]。筆者通過莖段誘導(dǎo)叢生芽建立的離體快繁體系能在短時間內(nèi)提供優(yōu)質(zhì)種苗，實(shí)現(xiàn)人工大規(guī)模栽培，對開發(fā)該藥用植物具有重要意義，報道如下。

1 材料和試劑

尼泊爾菊三七新鮮野生植株，采集于云南騰沖，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)孫啟時教授鑒定為尼泊爾菊三七。MS培養(yǎng)基，6－芐氨基嘌呤(6－BA)，萘乙酸(NAA)，蔗糖，瓊脂，酒精，升汞。

2 方法與結(jié)果

2.1 外植體的準(zhǔn)備

將3～6個月尼泊爾菊三七的幼嫩莖段用洗潔精清洗干凈后，再用蒸餾水浸泡數(shù)小時，瀝干水滴，備用。

2.2 外植體的滅菌與接種

將清洗好的尼泊爾菊三七莖段，放入燒杯中，用75%的乙醇溶液處理10～40 s，用0.1%的升汞溶液浸泡4～8 min，浸泡期間不斷搖動，使滅菌劑升汞和外植體充分接觸，進(jìn)行表面消毒，再用無菌蒸餾水清洗5～6次，將經(jīng)過消毒后的莖段切成0.5～1.0 cm且含有一個莖節(jié)的莖段，進(jìn)行接種誘導(dǎo)正交試驗(yàn)，確定其最佳消毒時間。以 75% 乙醇(因素 A)、0.1% 升汞(因素B)消毒時間為考察因素，誘導(dǎo)率和染菌率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表 2?？梢姡罴汛钆錇?A2B3，即用乙醇消毒20 s和升汞消毒6 min，誘導(dǎo)率最高且染菌數(shù)目最少。

2.3 試管苗的增殖培養(yǎng)

采用MS培養(yǎng)基，其中含有3%蔗糖、0.5%瓊脂，pH為6.0。培養(yǎng)溫度為(25±1)℃，光照時間為每天12h，光照強(qiáng)度為1400μmol/(m2·s)。設(shè)定好乙醇和升汞滅菌時間的同時，在MS培養(yǎng)基上，分別添加不同質(zhì)量濃度的 NAA(0，0.2，0.5，1.0 mg/L)和 6－BA(1.0，2.0，3.0，4.0 mg/L)。培養(yǎng)45 d后，進(jìn)行幼芽增殖統(tǒng)計(jì)，計(jì)算芽誘導(dǎo)率(出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù))，確定最佳外源激素配比。以6－BA(因素A)、NAA(因素B)的質(zhì)量濃度為考察指標(biāo)，繁殖率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，因素水平表見表3，試驗(yàn)結(jié)果見表4。在培養(yǎng)過程中，尼泊爾菊三七的莖段誘導(dǎo)成苗需要較長的時間，一般20 d后肉眼才能觀察到其形態(tài)變化。最初生長的小芽為嫩黃白色，隨著時間的延長逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色。經(jīng)過45 d的繼代培養(yǎng)，細(xì)胞分裂素6－BA均能誘導(dǎo)含有腋芽的尼泊爾菊三七莖段產(chǎn)生腋芽苗。由表4可知，各因素的最優(yōu)水平為A1和B3，即尼泊爾菊三七的繼代培養(yǎng)基添加劑素分別為NAA 0.5 mg/L和6－BA 1.0 mg/L，該激素濃度下的增殖倍數(shù)最大，達(dá)到4.8倍。

表1 尼泊爾菊三七的滅菌供試因素水平表

表2 尼泊爾菊三七的滅菌正交試驗(yàn)表 L16(45)

表3 尼泊爾菊三七叢生芽誘導(dǎo)供試因素水平表

2.4 壯苗與生根培養(yǎng)

將 2.5～3.0 cm 高的試管小苗接種于 1，1/2，1/4，1/6 MS4 種培養(yǎng)基并附加 6－BA1.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L、30 g/L 蔗糖、2 g/L活性炭進(jìn)行生根培養(yǎng)，45 d后觀察生長情況，統(tǒng)計(jì)生根率并確定無機(jī)元素最適合濃度。同時考察添加不同濃度的活性炭(1，2，5 g/L)對其壯苗和生根培養(yǎng)的影響，培養(yǎng)60 d，統(tǒng)計(jì)生根率并且確定添加活性炭最佳濃度(生根率=接種后的生根苗數(shù)/接種的試管苗數(shù))。結(jié)果見表5和表6。在植物離體快繁過程中，試管苗生根培養(yǎng)是最重要的步驟，是進(jìn)行移栽成苗的基礎(chǔ)[4]。通過調(diào)整基本培養(yǎng)基中的無機(jī)元素成分和含量，可以解決植物繁殖困難、生根率低的問題[5]。由表5可知，1/2MS培養(yǎng)基中根最長，須根生長旺盛，生根率最高，為85%?；钚蕴康臐舛仍谝欢ǔ潭壬蠒绊憻o菌苗的生根情況[5]。由表6可知，活性炭質(zhì)量濃度為2.0 g/L時，植株的生理狀態(tài)最佳，生根率最高，平均每株根數(shù)最多，主根比較長，須根也生長旺盛。

表4 尼泊爾菊三七的增殖培養(yǎng)基正交試驗(yàn)表 L16(45)

表5 無機(jī)元素濃度對尼泊爾菊三七生根的影響

表6 活性炭濃度對尼泊爾菊三七生根的影響

2.5 煉苗與移栽

尼泊爾菊三七在壯苗與生根培養(yǎng)基上生長45 d后，苗高度達(dá)到10 cm左右時，選取其中植株健壯、根系發(fā)達(dá)的組培苗，將敞開的組培瓶置室溫?zé)捗?～7 d后，除去根部的殘留培養(yǎng)基并植于含細(xì)砂的腐殖土中，保濕10～15 d，直接移栽到不同組成的基質(zhì)中考察其在不同基質(zhì)中的生長情況，待苗生長健壯后，移植于大地栽培。結(jié)果見表7。

表7 試管苗在不同移栽基質(zhì)中的生長情況

3 討論

以尼泊爾菊三七的莖段作為外植體，在以往文獻(xiàn)報道的配方基礎(chǔ)上[6]，改變消毒時間誘導(dǎo)得到無菌苗，最佳條件為乙醇消毒20 s，升汞消毒6 min。消毒時間越長，消毒劑對外植體的影響越大，外植體的染菌率雖能有所下降，但試管苗誘導(dǎo)率、長勢與污染率成反比。由外植體誘導(dǎo)的試管苗通過更換激素種類和濃度，運(yùn)用16種培養(yǎng)基對腋芽試管苗進(jìn)行增殖培養(yǎng)，其中MS+NAA 0.5 mg/L+6－BA 1.0 mg/L+30 g/L蔗糖+2 g/L活性炭最適合尼泊爾菊三七的試管苗增殖培養(yǎng)。其中6－BA的質(zhì)量濃度不宜過高，否則會刺激外植體的多酚氧化酶活性，加之試管苗在瓶中生長，容易產(chǎn)生乙烯，使得試管苗褐變現(xiàn)象加深，而且容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象[7]，其莖不易生根且繁殖系數(shù)下降。含有不同濃度無機(jī)元素的培養(yǎng)基和不同濃度活性炭對生根的試驗(yàn)表明，1/2 MS是最適宜的生根基本培養(yǎng)基，當(dāng)活性炭質(zhì)量濃度為2 g/L時，尼泊爾菊三七生根速度最快[8]。添加活性炭濃度過高時，培養(yǎng)基中的成分被其吸附，使苗的生長發(fā)育受阻;濃度適當(dāng)，可以使培養(yǎng)基環(huán)境變黑，有利于試管苗的生根和阻止在生長過程中釋放酚類物質(zhì)，促進(jìn)生長。關(guān)于尼泊爾菊三七的研究還比較少，本試驗(yàn)結(jié)果為保護(hù)該物種及今后更全面的研究與開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

[1]閔伶俐，唐源宏.菊三七屬植物研究進(jìn)展[J].中藥材，2009，32(8):1322－1325.

[2]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社，1988，77(1):314.

[3]謝從華.植物細(xì)胞工程[M].北京:高等教育出版社，2004:97－99.

[4]Kevers C，Hausman JF，F(xiàn)airre－Rampant O，et al.Hormonal control of adventitious rooting:progress and questions[J].J App Bot，1997，71:71－79.

[5]Ramage CM，Williams RR.Mineral.Nutrition and plant morphyogenesis[J].In Virto Cell Dev Biol Plant，2002，38:116－124.

[6]楊 樺，鄧小梅，龍 蔚.菊三七的組織培養(yǎng)[J].江西林業(yè)科技，2000(6):11－12.

[7]張 鵬，傅愛國，王愛同.AgNO3在植物離體培養(yǎng)中的作用及可能機(jī)制[J].植物生理學(xué)通訊，1997，33(5):376.

[8]劉用生，李友勇.植物組織培養(yǎng)活性炭的使用[J].植物生理學(xué)通訊，1994，30(3):24.