侯允天，郝光濤，鄭專杰，梁海霞，馬蒙，朱力軍，劉澤源

(1.解放軍總醫(yī)院老年心血管病研究所，北京 100853;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院附屬醫(yī)院臨床藥理室，北京 100071;3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安定醫(yī)院藥劑科，100088;4.蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系，安徽蚌埠 233030)

鹽酸特拉唑嗪(Terazosin)是一種新型高效的選擇性α1受體阻斷藥，對動脈和靜脈的α1受體有較高的選擇性阻斷作用，對去甲腎上腺能神經(jīng)末梢突觸前膜α2無明顯作用，因此在拮抗去甲腎上腺素和腎上腺素的升壓作用時，無促進(jìn)神經(jīng)末梢釋放去甲腎上腺素及明顯加快心率的作用，它是哌唑嗪的類似物，與哌唑嗪比較，特拉唑嗪的降壓作用出現(xiàn)較慢，且呈良好的線性量效關(guān)系而持續(xù)時間不變。但作用時間較長，半衰期(t1/2)較哌唑嗪長2～3倍，每天一次給藥即能有效控制24 h血壓［1-6］，是目前老年高血壓并發(fā)前列腺肥大患者臨床應(yīng)用的一種較好的降血壓藥。人體前列腺組織中的受體主要以α1腎上腺素能受體為主，而前列腺平滑肌的收縮主要受α1腎上腺素能受體的調(diào)控。因此，特拉唑嗪作為α1受體阻斷藥能減少前列腺尿道阻力，緩解排尿困難［7-10］，是一種治療良性前列腺增生較好的藥物。筆者在本研究建立高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(HPLC-MS/MS)法測定人體血漿中特拉唑嗪濃度，為特拉唑嗪藥動學(xué)探討提供方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津(SHIMADZU)高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)聯(lián)用儀，其中島津(SHIMADZU)高效液相色譜系統(tǒng)包括二元輸液泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱;串聯(lián)質(zhì)譜儀為API 3200型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，含電噴霧離子化源以及串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜檢測器。色譜工作站:Analyst 1.4.2數(shù)據(jù)處理軟件(美國 AB公司)。GL-88B旋渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);AB104電子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO公司);B600A型低速自動平衡離心機(中國白洋離心機廠);Milli-Q Plus純水器(美國密理博中國有限公司)。

1.2 試藥 鹽酸特拉唑嗪對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，含量 99.3%，批號:100375-200502)，鹽酸哌唑嗪對照品(內(nèi)標(biāo)，中國藥品生物制品檢定所提供，批號:100164-200402)，甲醇、乙腈均為色譜純(DIMA公司)，試驗用水為去離子水(本實驗室自制)，其他試劑為AR試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Inertsil-C18柱(2.1mm×150mm，3.0 μm);預(yù)柱:Shim-pack GVP-ODS(5mm ×2.0mm);流動相:甲醇-水(2mmol·L-1醋酸銨)=90∶10;流速:0.2mL·min-1;柱溫:20℃;進(jìn)樣量:5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源為ESI源;正離子方式檢測;多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)方式;噴射電壓:5 500 V;離子源溫度:450℃;源內(nèi)氣體1［氮氣(N2)］壓強:306 kPa;源內(nèi)氣體2(N2)壓強:374 kPa;氣簾氣體(N2)壓強:68 kPa;碰撞能量:45 V;DP電壓:65 V;碰撞氣(N2)壓力:40.8 kPa;用于定量分析的離子反應(yīng)對分別為質(zhì)荷比(m/z)388.4μm/z 247.4(特拉唑嗪)和 m/z384.2 μm/z 231.3(哌唑嗪，內(nèi)標(biāo))。

2.3 溶液的配制

2.3.1 鹽酸特拉唑嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取鹽酸特拉唑嗪對照品11.9 mg，相當(dāng)于特拉唑嗪10 mg，置于50mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得200.0 μg·mL-1特拉唑嗪的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，取該儲備液1.25mL置于50mL量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得5 000 ng·mL-1特拉唑嗪甲醇溶液;再以甲醇依次倍比稀釋，配成濃度分別為250，100，25，10，5，2 和 1 ng·mL-1的特拉唑嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)(哌唑嗪)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取鹽酸哌唑嗪對照品11.0 mg，置于10mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得100.0 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲備液，取該儲備液加入甲醇倍比稀釋至100.0 ng·mL-1，作為內(nèi)標(biāo)工作溶液待用。對照品溶液于4℃冰箱保存待用。

2.4 樣品預(yù)處理 精密量取血漿樣品200 μL，置10mL磨口玻璃試管中，分別加入100 ng·mL-1哌唑嗪甲醇溶液(內(nèi)標(biāo)溶液)40 μL、甲醇 40 μL、飽和碳酸鈉溶液100 μL，漩渦混合30 s，再加入叔丁基甲醚2mL，充分渦旋震蕩2 min，2 500 r·min-1離心5 min，取上清液叔丁基甲醚置于旋口玻璃試管中40℃水浴氮氣揮干，殘渣用200 μL流動相復(fù)溶，進(jìn)樣5 μL進(jìn)行HPLCMS/MS分析。

2.5 分析方法確證

2.5.1 質(zhì)譜分析 取特拉唑嗪和哌唑嗪標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量用甲醇稀釋成濃度為1.0 μg·mL-1的甲醇溶液，按“2.2”項操作，相應(yīng)的二級全掃描質(zhì)譜圖見圖1。

2.5.2 相對基質(zhì)效應(yīng)考察 分別取6個不同受試者的空白血漿200 μL，置于10mL磨口玻璃試管中，按“2.4”項下操作，進(jìn)樣量為5 μL，每個受試者空白血漿各做3份;并同時做一條隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血漿樣品實測濃度。結(jié)果顯示所有試驗測定值與標(biāo)示量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均在±20% 之間，精密度為9.07%(＜15%)，則可認(rèn)為沒有基質(zhì)效應(yīng)干擾［11］。

圖1 特拉唑嗪和內(nèi)標(biāo)哌唑嗪的產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖A.特拉唑嗪;B.哌唑嗪(內(nèi)標(biāo))Fig.1 Full-scan production spectra of terazosin and internal standardA.terazosin;B.prazosin(internal standard)

2.5.3 方法專屬性 分別取6名受試者的空白血漿200 μL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液并另外補加甲醇40 μL外，其余按“2.4”項下方法操作，進(jìn)樣5 μL，獲得空白樣品的色譜圖(圖2A);將一定濃度的特拉唑嗪標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)哌唑嗪溶液加入空白血漿中，依同法進(jìn)行樣品處理，獲得相應(yīng)的色譜圖:最低定量限(圖2B)，標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度(圖2C);取受試者給藥后收集的血漿樣品，依同法進(jìn)行樣品處理，獲得相應(yīng)的色譜圖(圖2D)。結(jié)果表明，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾特拉唑嗪和哌唑嗪的測定。

圖2 血漿中特拉唑嗪(Ⅰ)和內(nèi)標(biāo)哌唑嗪(Ⅱ)的典型MRM色譜圖A.空白血漿;B.空白血漿中加入0.2 ng·mL-1特拉唑嗪和100 ng·mL-1哌唑嗪;C.空白血漿中加入2 ng·mL-1特拉唑嗪和100 ng·mL-1哌唑嗪;D.1號受試者第Ⅰ周期第3個點的血漿樣品Fig.2 Typical MRM chromatograms of terazosin(Ⅰ)and prazosin(Ⅱ)in plasma samplesA.Blank plasma;B.Blank plasma spiked with 0.2 ng·mL-1 terazosin and 100 ng·mL-1prazosin;C.Blank plasma spiked with 2 ng·mL-1terazosin and 100 ng·mL-1prazosin;D.Plasma sample from No.1 volunteer at the 3rd time point in the 1st periodicity

2.5.4 線性關(guān)系考察 取空白血漿200 μL，分別精密加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的特拉唑嗪對照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各40 μL，渦旋混勻，配成特拉唑嗪濃度分別為0.2，0.5，1，2，5，20 和 50 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血漿，按“2.4”項下操作，記錄色譜圖，以血漿中待測物濃度(X)為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值(Y)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(w=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運算［12］，得回歸方程:Y=0.006X+0.025 4，r=0.997 3，特拉唑嗪的線性范圍是0.2 ～50.0 ng·mL-1，定量下限為0.2 ng·mL-1。

2.5.5 精密度和準(zhǔn)確度 按“2.5.3”項分別制備特拉唑嗪低、中、高 3個濃度血漿樣品 0.5，2，20 ng·mL-1的質(zhì)量控制樣品，每個濃度6份樣品，連續(xù)測定3 d，得血漿中特拉唑嗪血漿中低、中、高濃度的平均日內(nèi)RSD 分別為8.64%，3.77%和 10.55%，日間 RSD 分別為8.15%，9.37%和 9.30%，均＜15%，平均相對回收率分別為(100.67±9.03)%，(98.83±4.37)% 和(99.25±11.03)%，低、中、高絕對回收率在分別為75.40%，70.28%，67.39%。

2.5.6 樣品穩(wěn)定性考察 制備血漿樣品的低、中、高(0.5，2，20 ng·mL-1)三個濃度的質(zhì)控樣品，分別進(jìn)行了進(jìn)樣器放置6 h、室溫放置4 h、反復(fù)凍融3次(－20℃)和長期穩(wěn)定性(－20℃冰凍放置30 d)4種穩(wěn)定性的考察，結(jié)果顯示所有穩(wěn)定性實驗中實測值與添加值的RSD均＜15%，表明特拉唑嗪血漿樣品在進(jìn)樣器中放置6 h、室溫放置4 h、反復(fù)凍融3次(－20℃)及－20℃凍存1個月條件下穩(wěn)定性良好。

3 討論

筆者在本試驗采用HPLC-MS/MS法測定特拉唑嗪血藥濃度，具有選擇性好、靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點。特拉唑嗪在人體血漿中濃度較低，本法測定的定量下限較其他方法低(0.2 ng·mL-1)［13-14］可以更準(zhǔn)確測定血漿中的濃度，且方法簡便可靠。

特拉唑嗪為生物堿，常制成鹽酸鹽，故需加入碳酸鈉進(jìn)行中和以使特拉唑嗪游離在有機相叔丁基甲醚中，從而進(jìn)行液相提取。在氮氣流下吹干濃縮可以大大提高分析方法的靈敏度，使樣品富集更徹底，不但簡化樣品處理方法，更減輕受試者的負(fù)擔(dān)，成本較低，更適合于本研究，可見此方法是一種優(yōu)先的前處理方案。

本試驗建立的血漿特拉唑嗪的 HPLC-MS/MS測定法簡單，靈敏，適合特拉唑嗪藥動學(xué)的研究。

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