胡浩然，石 勇，陳 雄

(湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院 發(fā)酵工程省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068)

丙酮酸(Pyruvic acid)，又稱2-氧代丙酸、乙?；姿峄颚?酮基丙酸，為無色至淡黃色液體，呈醋酸香氣和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不僅在生物能量代謝中具有十分重要的作用，而且是多種有機化合物的前體，因此，在化工、制藥等工業(yè)領(lǐng)域及科學(xué)研究中都有廣泛的用途[1]。近年來，對丙酮酸及其衍生系列產(chǎn)品的開發(fā)利用正日益深入，商業(yè)需求持續(xù)增長[2]。

早在20世紀90年代，丙酮酸就實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)，采用的工藝為酒石酸脫水脫羧法，但丙酮酸產(chǎn)率較低。日本學(xué)者經(jīng)過近40年的研究選育出了丙酮酸高產(chǎn)菌株，并于1989年率先實現(xiàn)了流加培養(yǎng)技術(shù)工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸，產(chǎn)酸量達67.8 g·L-1。作者在此以光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)為出發(fā)菌，通過紫外、化學(xué)誘變的方法選育出營養(yǎng)缺陷型丙酮酸高產(chǎn)菌，并對其產(chǎn)酸性能進行了初步的研究。

1 實驗

1.1 出發(fā)菌株

光滑球擬酵母(Torulopsisglabrata)HB20，自行保藏。

1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基：無水葡萄糖 20 g，酵母抽提物 20 g，蛋白胨 20 g，蒸餾水 1000 mL，瓊脂 20 g，pH值5.5。

(2)種子培養(yǎng)基：無水葡萄糖 100 g，蛋白胨 30 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水 1000 mL，pH值5.5。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：無水葡萄糖 100 g，(NH4)2SO46 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，鹽酸硫胺素 0.03 mg，鹽酸吡哆醇 1.0 mg，生物素 0.03 mg，煙酸 8.00 mg，CaCO340 g，蒸餾水1000 mL，pH值5.5[3]。

(4)溴甲酚綠固體完全培養(yǎng)基：無水葡萄糖 40 g，(NH4)2SO43 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，鹽酸硫胺素 0.03 mg，鹽酸吡哆醇 1.0 mg，生物素 0.03 mg，煙酸 8.00 mg，1% 溴甲酚綠乙醇溶液 20 mL，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH值5.5。

(5)基本培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，pH值5.5。

1.3 培養(yǎng)方法

從新鮮斜面上接一環(huán)菌于種子培養(yǎng)基，在30℃、220 r·min-1下培養(yǎng)24 h后，以10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵裝液量為100 mL/500 mL錐形瓶，轉(zhuǎn)速為220 r·min-1，發(fā)酵時間為60 h。

1.4 誘變方法及突變株的篩選

取5 mL培養(yǎng)液于4800 r·min-1離心10 min，收集菌體，用5 mL pH值7.0的磷酸鈉緩沖溶液洗2次，然后將菌體重新懸浮于適量的緩沖溶液中，制成細胞濃度為1×107個·mL-1的菌懸液。

UV誘變：開啟25 W紫外燈，使光波穩(wěn)定30 min，備用。吸取8 mL待測菌懸液，移入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，使液面高度在2 mm左右。距離紫外燈管25 cm處垂直照射一定時間，照射時打開培養(yǎng)皿，并采用電磁攪拌器緩慢振蕩。關(guān)閉紫外燈，開啟紅光燈，取0.2 mL UV誘變的菌液涂布于溴甲酚綠培養(yǎng)基平板上。將涂布好的平板用黑紙包好，放入30℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2～3 d?；罹嫈?shù)并與對照比較，計算致死率。在最佳誘變劑量下誘變處理原菌，稀釋梯度涂布平板，根據(jù)變色圈大小初篩出一批菌株，將這些菌株與原菌同時進行搖瓶發(fā)酵實驗，復(fù)篩出產(chǎn)酸量較高的菌株。

DES誘變：吸取700 μL UV誘變菌液加入到裝有20 mL緩沖溶液的錐形瓶中，稀釋30倍，加入0.2 mL DES，使DES在菌懸液中的體積分數(shù)約為1%。38℃振蕩處理一定時間，加250 μL 25%硫代硫酸鈉到試管中，終止反應(yīng)，并涂平板。與對照比較，計算致死率。在最佳誘變劑量下誘變處理UV誘變復(fù)篩出的菌株，同樣根據(jù)變色圈大小初篩、搖瓶發(fā)酵實驗復(fù)篩出產(chǎn)酸量較高的菌株。

1.5 分析方法

生物量測定：發(fā)酵液稀釋至相應(yīng)倍數(shù)，于660 nm可見光下測定其吸光值。

葡萄糖含量測定：采用3，5-二硝基水楊酸法(DNS)[4]。

丙酮酸含量測定：采用2，4-二硝基苯肼比色法[5]。

維生素缺陷型的鑒定：將待鑒定的菌株接到基本培養(yǎng)基平板上，將浸有維生素營養(yǎng)物質(zhì)混合液的濾紙片貼在平板上，培養(yǎng)2～3 d，觀察其生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的誘變選育

2.1.1 致死率和正突變率的比較

采用不同的UV和DES誘變劑量對菌株進行誘變處理，所得致死率和正突變率見表1。

表1 UV和DES誘變處理的致死率和正突變率/%

由表1可知，UV誘變40 s和DES誘變16 min的致死率都介于60%～80%之間，且正突變率都較高。因此，選取UV誘變40 s、DES誘變16 min選育菌種。

2.1.2 UV誘變的初篩與復(fù)篩

經(jīng)最佳劑量的UV誘變后，挑取變色圈與菌落直徑比較大的單菌落初篩出一批菌株。將這些菌株與原菌同時進行搖瓶發(fā)酵實驗，比較各菌株的產(chǎn)酸量，復(fù)篩出8株產(chǎn)量較高的菌株，其產(chǎn)酸量見表2。

表2 UV突變株與原菌產(chǎn)酸量比較/g·L-1

2.1.3 DES誘變的初篩與復(fù)篩

將經(jīng)UV誘變篩選出的8株突變株經(jīng)DES誘變處理后，從溴甲酚綠固體完全培養(yǎng)基上初選出5株菌，分別命名為HB301、HB302、HB303、HB304、HB305，把它們與原菌接到發(fā)酵培養(yǎng)基中進行搖瓶培養(yǎng)，其產(chǎn)酸量見表3。

表3 UV-DES突變株與原菌產(chǎn)酸量比較/g·L-1

由表3可知，HB304比原菌HB20產(chǎn)酸量增加了31.2%。

將獲得的5株突變株分別轉(zhuǎn)接斜面5代，1、3、5代每代轉(zhuǎn)接3個搖瓶進行發(fā)酵實驗，考察產(chǎn)酸能力的遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 UV-DES突變株的遺傳穩(wěn)定性/g·L-1

由表4可知，HB304在傳代過程中產(chǎn)酸能力穩(wěn)定，而HB305株菌在傳代3次后，產(chǎn)酸能力有所下降。綜合考慮菌株的產(chǎn)酸能力和遺傳穩(wěn)定性，確定突變株HB304為進一步研究用菌株。

2.2 產(chǎn)丙酮酸突變株HB304的維生素需求鑒定及分析

對產(chǎn)丙酮酸突變株HB304的維生素需求進行鑒定，結(jié)果見表5。

表5 各種維生素對HB304生長的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，在不含鹽酸硫胺素、煙酸、鹽酸吡哆醇、生物素而含有其它維生素的濾紙片周圍無菌落出現(xiàn)，在含有鹽酸硫胺素、煙酸、鹽酸吡哆醇、生物素而缺少其它維生素的濾紙片周圍出現(xiàn)菌落。說明產(chǎn)丙酮酸突變株HB304是鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸和生物素4種維生素的缺陷型。研究表明，球擬酵母屬菌株，特別是維生素營養(yǎng)缺陷型的菌株更能大量地積累丙酮酸。由于丙酮酸脫氫酶系的輔因子為煙酸和鹽酸硫胺素、丙酮酸羧化酶的輔因子為生物素、丙酮酸脫羧酶的輔因子是鹽酸硫胺素，營養(yǎng)缺陷型菌株自身無法合成這些維生素，因此，當這些維生素的濃度處于亞適量水平時，丙酮酸就得以積累。

2.3 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.3.1 葡萄糖初始濃度的確定

以葡萄糖為碳源、(NH4)2SO4為氮源，固定(NH4)2SO4濃度為6.0 g·L-1，考察葡萄糖初始濃度對發(fā)酵的影響，結(jié)果見表6。

表6 葡萄糖初始濃度對發(fā)酵的影響

由表6可知，葡萄糖初始濃度在60～100 g·L-1時，菌體濃度、丙酮酸產(chǎn)量及殘?zhí)菨舛入S其濃度的增加而上升；葡萄糖初始濃度在100～140 g·L-1時，菌體濃度、丙酮酸產(chǎn)量隨其濃度的增加而降低，殘?zhí)菨舛纫廊簧仙?。這表明過高的葡萄糖初始濃度對菌體生長產(chǎn)生抑制，導(dǎo)致殘?zhí)菨舛仍黾?，浪費了原料，提高了生產(chǎn)成本；而葡萄糖初始濃度過低又會使發(fā)酵過早結(jié)束，微生物利用完葡萄糖后又轉(zhuǎn)而利用丙酮酸，導(dǎo)致丙酮酸產(chǎn)量降低。

2.3.2 (NH4)2SO4濃度的確定

固定葡萄糖初始濃度為100 g·L-1，考察(NH4)2SO4濃度對發(fā)酵的影響，結(jié)果見表7。

表7 (NH4)2SO4濃度對發(fā)酵的影響

因此，優(yōu)化的葡萄糖初始濃度為100 g·L-1、(NH4)2SO4濃度為7.0 g·L-1，此時菌體生長較好，丙酮酸產(chǎn)量較高，達19.19 g·L-1，較原菌提高了41.9%。

2.4 討論

糖酵解途徑的最終產(chǎn)物丙酮酸處于代謝途徑中的關(guān)鍵代謝支點，在細胞中很容易代謝為其它產(chǎn)物，難以積累。要使其在細胞中積累并分泌到胞外，就只有切斷或弱化丙酮酸的進一步代謝。提高丙酮酸產(chǎn)量的方法主要有：(1)在保證細胞正常代謝的前提下，盡可能減少丙酮酸的降解或轉(zhuǎn)化；(2)加快從葡萄糖到丙酮酸的代謝速度，以確保獲得丙酮酸的高生產(chǎn)強度[6]。實驗中篩選出的HB304是鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸和生物素的營養(yǎng)缺陷型突變株，而這4種維生素直接影響了丙酮酸在細胞內(nèi)的代謝。

3 結(jié)論

通過誘變育種篩選出的產(chǎn)丙酮酸突變株HB304在培養(yǎng)基未經(jīng)優(yōu)化的條件下，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸量較原菌提高了31.2%，通過初步優(yōu)化培養(yǎng)基初始碳、氮源，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酸量較原菌提高了41.9%。作為多種維生素營養(yǎng)缺陷型的HB304具備大量積累丙酮酸的潛力，通過進一步優(yōu)化培養(yǎng)基成分，提高丙酮酸的產(chǎn)量，最終可望用于工業(yè)化生產(chǎn)。

[1] 陳堅，李寅.發(fā)酵過程優(yōu)化原理與實踐[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：129-130.

[2] 李寅，陳堅，陳燕，等.丙酮酸高產(chǎn)菌株的選育及中試研究[J].工業(yè)微生物，2001，31(2)：10-13.

[3] Hua Qiang，Araki Minako，Koide Yohko，et al. Effects of glucose，vitamins，and DO concentrations on pyruvate fermentation usingTorulopsisglabrataIFO 0005 with metabolic flux analysis[J]. Biotechnol Prog，2001，17(1)：62-68.

[4] 陳毓荃.生物化學(xué)實驗方法和技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，2002：97-100.

[5] 張宗祥.采用微生物發(fā)酵制取丙酮酸的研究[D].南京：南京理工大學(xué)，2004.

[6] 李寅，陳堅，倫世儀，等.維生素在丙酮酸過量合成中的重要作用[J].微生物學(xué)報，2000，40(5)：528-534.