馬莎莎,張 凡,舒福昌,侯讀杰,佘躍惠
(1.長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 荊州 434023;2中國地質(zhì)大學(xué)(北京)能源學(xué)院,北京 100080)
硝酸鹽還原菌(Nitrate reducing bacteria,NRB)和硫酸鹽還原菌(Sulfate reducing bacteria,SRB)是油田普遍存在的兩類微生物菌群。原油的酸化和管道的腐蝕主要是由SRB還原硫酸鹽產(chǎn)生H2S所導(dǎo)致的[1,2]。抑制SRB的活性、減少H2S的產(chǎn)生是油田生產(chǎn)的一項(xiàng)十分重要的工作。除了化學(xué)殺菌處理外,目前最為環(huán)保的抑制SRB活性的方法是生物競爭排除技術(shù)(Biocompetitive exclusion)[3],該技術(shù)是利用硝酸鹽還原菌、亞硝酸鹽還原菌以及反硝化微生物阻止SRB獲得所需營養(yǎng)物而抑制其產(chǎn)H2S的活性[4]。目前,大多研究僅針對(duì)單個(gè)菌株對(duì)H2S產(chǎn)生的影響,但油田微生物菌群較為復(fù)雜,菌群之間相互影響,因此,對(duì)微生物菌群進(jìn)行全面的認(rèn)識(shí)對(duì)生物競爭技術(shù)研究是很有必要的。隨著分子生物學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育分析方法的發(fā)展,基于16S rRNA(rDNA)的分子生物學(xué)方法被用來分析復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng),特別是構(gòu)建16S rDNA PCR擴(kuò)增片段克隆文庫來分析微生物菌群組成[5]。
作者在此直接采集油井井口樣品接種于NRB和SRB富集培養(yǎng)基中培養(yǎng),通過克隆文庫分析富集培養(yǎng)物中的微生物菌群,以期為油田開發(fā)NRB抑制硫酸鹽還原作用新技術(shù)提供理論依據(jù)。
樣品采自新疆克拉瑪依油田六中區(qū)克下組油井T6191井口,該油層含油面積10.3 km2、地質(zhì)儲(chǔ)量2.084×107t,屬克拉瑪依Ⅲ類礫巖油藏。該油井產(chǎn)出液平均含水量2.1%,原油相對(duì)密度0.899,地層原油粘度80 mPa·s,凝固點(diǎn)-49℃,含蠟量3%,含膠量58%,屬于低溫輕質(zhì)稠油油藏。井口油水樣品被直接裝入無菌瓶,在進(jìn)行分子實(shí)驗(yàn)前于4℃保存。
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入不同的碳源和能源用來富集NRB和SRB菌群。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1 L):10 g NaCl,3 g MgCl2·6H2O,0.15 g CaCl2·2H2O,0.25 g KCl,0.6 g KBr,0.5 g KH2PO4,pH值7.0。
NRB富集培養(yǎng)基:1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入3 g KNO3,1 g乙酸鈉,1 g酵母膏,1 mL刃天青母液 (1%),pH值7.0。
SRB富集培養(yǎng)基:1 L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入 4 g Na2SO4,1 g乙酸鈉,1 g酵母膏,1 mL刃天青母液 (1%),pH值7.0。
所有培養(yǎng)基被分裝入250 mL厭氧瓶中通入N2,高壓濕熱滅菌后,按30 mL·L-1加入1 mol·L-1NaHCO3、按1 mL·L-1加入微量元素母液和維生素母液[6]。培養(yǎng)基中接種2% (體積分?jǐn)?shù))產(chǎn)出水和5%(質(zhì)量濃度)原油,按地層溫度25℃培養(yǎng)120 d。
1.3.1 富集產(chǎn)物DNA的提取
吸取2 mL富集培養(yǎng)液,于12 000 r·min-1離心10 min收集菌體細(xì)胞。根據(jù)FastDNA Spin Kit for Soil (Qbiogen,Carlsbad,CA.U.S.A)試劑盒說明提取基因組DNA。采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。
1.3.2 16S rRNA基因全長擴(kuò)增
使用16S rDNA片段擴(kuò)增通用引物27f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′),從基因組總DNA中擴(kuò)增16S rDNA片段。PCR擴(kuò)增體系及程序參照文獻(xiàn)[7]。
用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[Agarose Gel DNA Purification Kit (TianGen Biotech,Beijing,China)]對(duì)16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行割膠、純化。然后將回收產(chǎn)物16S rDNA片段pGEM T-easy克隆載體(Promega),通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 competent cells (TransGen Biotech,Beijing,China)中。從2個(gè)文庫各挑取100個(gè)白斑克隆,以少量菌體作為模板通過載體通用引物T7/SP6擴(kuò)增來檢測(cè)陽性克隆。PCR產(chǎn)物先用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ 和HhaⅠ進(jìn)行酶切,再用2%瓊脂糖凝膠電泳分析限制性片段,最后對(duì)電泳圖譜進(jìn)行限制性酶切片段長度多態(tài)性(ARDRA)分析[8]。將酶切圖譜相同的克隆歸為一個(gè)發(fā)育類型(OTU)。
應(yīng)用Rarefaction分析軟件(http://www.uga.edu/strata/software/software.html)對(duì)克隆文庫的庫容飽和度進(jìn)行分析,以檢測(cè)建立的克隆文庫是否已經(jīng)足夠全面地代表NRB和SRB菌群的多樣性。
挑取ARDRA分型歸為一類的代表性克隆接種于含有100 μg·mL-1氨芐的液體LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)20 h后送測(cè)序公司(SinoGenoMax Co.,Ltd.,Beijing,China)測(cè)序。所得序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行處理,并在NCBI(National Center for Biotechnology,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫中比對(duì)分析,尋找親緣關(guān)系最近的序列用DNAMAN軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
在NRB和SRB的16S rRNA基因克隆文庫DGS1和DGS2中各選擇100個(gè)陽性克隆子,通過HaeⅢ和HhaⅠ雙酶切分型分為了11和12個(gè)OTU。Rarefaction分析曲線(圖1)顯示,當(dāng)陽性克隆子達(dá)到90個(gè)時(shí)曲線趨于水平,說明克隆文庫能夠反映樣品微生物菌群結(jié)構(gòu)。
圖1 克隆文庫DGS1和DGS2的Rarefaction分析曲線
16S rRNA基因克隆文庫NRB和SRB的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。
各分支后的數(shù)字代表該系統(tǒng)發(fā)育類型在克隆文庫中所占的比例
由圖2可知,克隆文庫NRB中優(yōu)勢(shì)菌群為施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)(35%)、未培養(yǎng)擬桿菌(UnculturedBacteroidetesbacterium)(37%)、螺旋體(Spirochaeta)(9%)和產(chǎn)氨基酸桿菌(Acidaminobacterhydrogenoformans)(9%)??寺∥膸霺RB中優(yōu)勢(shì)菌群為脫硫弧菌(Desulfovibriocaledoniensis)(43%)、未培養(yǎng)擬桿菌(20%)、脫硫單胞菌(Desulfuromonasmichiganensis)(12%)和螺旋體(8%)。將所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中對(duì)比分析,結(jié)果表明,大多數(shù)序列(>90%)和GenBank中已有的16S rDNA序列同源性大于97%,說明該富集培養(yǎng)物中微生物的可培養(yǎng)性。雖然NRB和SRB菌群為兩種不同培養(yǎng)基的富集產(chǎn)物(圖3),其優(yōu)勢(shì)菌群不同,但是未培養(yǎng)擬桿菌和螺旋體在2個(gè)文庫中均出現(xiàn)了,說明這兩種菌能在兩種培養(yǎng)基中生長。特別是未培養(yǎng)擬桿菌在2個(gè)文庫中都為優(yōu)勢(shì)菌。
圖3 硝酸鹽還原菌和硫酸鹽還原菌富集培養(yǎng)物中菌群分布關(guān)系
NRB和SRB富集產(chǎn)物微生物菌群結(jié)構(gòu)存在差異。NRB富集培養(yǎng)物中施氏假單胞菌占35%,它是油田常見菌群,能將硝酸鹽還原成氮并且能代謝多種有機(jī)物[9];SRB富集培養(yǎng)物中脫硫弧菌、脫硫單胞菌、梭狀芽孢桿菌(Clostridiabacterium)都是典型的硫酸鹽還原菌,大約覆蓋了文庫的60%。由此可知富集培養(yǎng)產(chǎn)物為目的產(chǎn)物。
NRB和SRB富集產(chǎn)物微生物菌群雖然存在差異,但是未培養(yǎng)擬桿菌和螺旋體在2個(gè)文庫中都出現(xiàn),特別是未培養(yǎng)擬桿菌在2個(gè)文庫中均為優(yōu)勢(shì)菌,這可能是由于在富集培養(yǎng)基中加入了原油,而擬桿菌和螺旋體是一類能以烴為碳源的菌群[10,11]。因此在兩個(gè)加有原油的富集培養(yǎng)基中出現(xiàn)這類以烴為碳源的菌群并且形成一定優(yōu)勢(shì)。因?yàn)樵蛢?chǔ)層中不可避免地存在原油,為了能更好地模擬儲(chǔ)層環(huán)境,在富集培養(yǎng)基中加入原油是有必要的。
SRB富集產(chǎn)物中出現(xiàn)了一定量的硫磺單胞菌屬(Sulfurospirillum),這類菌的出現(xiàn)可能是由于培養(yǎng)基中硫化物含量增加所致,同時(shí)它們也是油田生物競爭排除技術(shù)的目的菌群,是后續(xù)研究工作的重點(diǎn)所在。
基于16S rDNA分子克隆文庫方法,分析新疆克拉瑪依油田六中區(qū)采油井T6191井口樣品硝酸鹽還原菌(NRB)和硫酸鹽還原菌(SRB)富集產(chǎn)物的菌群多樣性。16S rRNA基因克隆建庫結(jié)果表明,NRB和SRB菌群存在明顯的差異,其優(yōu)勢(shì)菌不同,前者主要為降烴菌,后者則與硫酸鹽還原作用密切相關(guān);NRB和SRB菌群中同時(shí)存在未培養(yǎng)擬桿菌和螺旋體,這與原油儲(chǔ)層環(huán)境有關(guān),它們均能降解石油烴,菌群分析結(jié)果為油田開發(fā)NRB抑制硫酸鹽還原作用新技術(shù)提供了理論依據(jù)。
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