焦虎 范金財(cái) 劉立強(qiáng) 田佳 甘承 馮蘇云 付思祺 陳文霖

人工皮膚替代物的研究已經(jīng)有30多年的歷史，早在1975年的時候，Rheinwald等[1]就培養(yǎng)出了與正常表皮層非常類似的復(fù)層的表皮細(xì)胞膜片。1979年，Bell等[2]第一次將成纖維細(xì)胞種植在膠原網(wǎng)上，構(gòu)建了真皮替代物。后來有研究將組織工程表皮替代物和真皮替代物結(jié)合，構(gòu)建了既含有表皮結(jié)構(gòu)又含有真皮結(jié)構(gòu)的復(fù)合皮膚替代物。但目前的組織工程皮膚替代物都不具有附屬器結(jié)構(gòu)，所以移植愈合后的創(chuàng)面皮膚與正常皮膚在色澤、質(zhì)地、濕度和功能等方面有較大的差距。

另外，對于一些較大面積的頭皮缺損，用現(xiàn)有的毛發(fā)移植技術(shù)進(jìn)行毛發(fā)的修復(fù)重建難度較大。如果能夠構(gòu)建出帶毛發(fā)的組織工程皮膚替代物，就可以在修復(fù)皮膚缺損的同時，一期完成毛發(fā)的修復(fù)重建。因此，構(gòu)建帶附屬器的組織工程皮膚成了組織工程皮膚研究的難題和未來的發(fā)展方向。本研究遵循毛囊形成基本原理，將毛乳頭細(xì)胞和表皮細(xì)胞充分混合后，引入皮膚替代物內(nèi)，使兩者相互作用，以期構(gòu)建出帶毛囊的組織工程皮膚替代物。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)液、Ham’s F12培養(yǎng)液(HyClone公司，美國)；表皮生長因子(Peprotech公司，美國)；胰島素、氫化可的松(北京優(yōu)博奧生物科技有限公司)；霍亂毒素(北京邁晨科技有限公司)；轉(zhuǎn)鐵蛋白(Sigma公司，美國)；鼠抗人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)一抗(武漢博士德生物工程有限公司)；熒光標(biāo)記兔抗鼠二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)。倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.2 角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)

皮膚標(biāo)本來自外科手術(shù)中切下的正常皮膚，角質(zhì)形成細(xì)胞的培養(yǎng)方法同文獻(xiàn)[3]。將皮膚用0.25%的中性蛋白酶溶液4℃消化過夜。撕下表皮層并用0.05%胰酶-0.02%EDTA溶液37℃消化15 min后，吹打使表皮細(xì)胞游離下來。將得到的表皮細(xì)胞懸液離心后，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基:DMEM和Ham’s F12混合液(3∶1)、10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素、0.2 μg/mL氫化考地松、0.02 μg/mL EGF、5 μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、5 μg/mL胰島素和8 μg/mL霍亂毒素。

1.3 毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)

毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)采用酶消化法。頭皮用0.25%中性蛋白酶4℃消化過夜。將含有毛囊下段的皮下組織切下并剪成泥狀。在泥狀的皮下組織中加PBS吹打混勻后，以2 000 r/min的速度離心5 min。離心后獲取沉淀，用0.2%的Ⅰ型膠原酶37℃消化2～2.5 h后，加入PBS并反復(fù)吹打使毛乳頭從周圍組織中分離出來。1 000 r/min離心5 min，棄去未徹底消化的纖維組織后，將液體反復(fù)吹打混勻，靜止十幾秒待大塊組織沉淀后，吸取含有毛乳頭的上清，300 r/min離心3 min。離心后將沉淀移入35 mm培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)毛乳頭總數(shù)，按每35 mm培養(yǎng)皿10個毛乳頭的密度接種。毛乳頭細(xì)胞培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和100 U/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。

1.4 免疫熒光染色

取第3代毛乳頭細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定后，用0.1%Triton室溫孵育5 min。用1%BSA漂洗6次，每次5 min，封閉非特異性抗原。加入鼠抗人α-SMA一抗(1∶100稀釋)，4℃孵育過夜。0.1%BSA漂洗6次，每次5 min，去除未結(jié)合一抗。加入兔抗鼠熒光標(biāo)記二抗(1∶300稀釋)，室溫孵育1 h。0.1%BSA漂洗6次，每次5 min，去除未結(jié)合二抗，DAPI染核。

1.5 組織工程皮膚替代物的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)組:取第3代的人毛乳頭細(xì)胞和第1代的人角質(zhì)形成細(xì)胞各4×105個，用角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基混合制成760 μL的細(xì)胞懸液，并放置于冰浴中備用。將200 μL的Ⅰ型鼠尾膠原蛋白(5 mg/mL)加到12 μL濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液中，再加入23 μL的10×DMEM培養(yǎng)基混勻。加入已制備好的760 μL的細(xì)胞懸液，混勻后立即加到24孔板中。室溫下放置20 min，待膠凝固。然后再在膠的表面種植2×105個角質(zhì)形成細(xì)胞，加入適當(dāng)體積的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，浸沒培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)為氣-液界面培養(yǎng)5 d。

對照組:760 μL的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基中不加任何細(xì)胞，其余步驟同上，構(gòu)建出的皮膚替代物的真皮層。

1.6 組織工程皮膚替代物的移植

實(shí)驗(yàn)采用4～6周齡雄性裸鼠，實(shí)驗(yàn)組和對照組各12只。以1%異戊巴比妥鈉(80 mg/Kg劑量)腹腔注射麻醉后，在裸鼠背部形成直徑為1 cm的全層圓形皮膚缺損。將構(gòu)建的皮膚替代物移植到裸鼠背部覆蓋創(chuàng)面。移植后觀察各組創(chuàng)面愈合情況，比較實(shí)驗(yàn)組和對照組皮膚替代物收縮的情況。每組分別于術(shù)后第4、6、8周各處死裸鼠4只，從移植區(qū)域的中心部位切取皮膚替代物，行組織學(xué)觀察。

1.7 HE染色

取材后以中性福爾馬林固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，5 μm厚度切片，HE染色觀察。

2 結(jié)果

2.1 酶消化法獲得毛乳頭細(xì)胞

剛剛遷出的細(xì)胞多為三角形，隨著細(xì)胞繼續(xù)遷出，細(xì)胞形態(tài)多為長梭形，類似成纖維細(xì)胞，但兩端較扁平多突起，胞質(zhì)內(nèi)可見羽狀紋理(圖1)。細(xì)胞有明顯聚集生長特性，前3代細(xì)胞可形成由幾層細(xì)胞構(gòu)成的圓形聚集體(圖2)。細(xì)胞最多可傳7代。毛乳頭細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA在酶消化法培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)陽性(圖3)，說明這些細(xì)胞是毛乳頭細(xì)胞。

2.2 創(chuàng)面愈合情況

移植后2周，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合較好，無創(chuàng)面裸露，表面紅潤(圖4)；對照組創(chuàng)面愈合較差，局部創(chuàng)面裸露，充血嚴(yán)重，有滲出(圖5)。移植后3周，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面已完全愈合，創(chuàng)面干燥開始收縮，并且移植物表面出現(xiàn)脫屑現(xiàn)象；對照組仍未完全愈合，尚有較大痂皮，但已無充血(圖6)。移植后4周，對照組創(chuàng)面完全愈合，兩組都已出現(xiàn)較大收縮，但對照組收縮更為明顯(圖7)。直到移植后8周，兩組創(chuàng)面均未見毛發(fā)長出。

2.3 實(shí)驗(yàn)組真皮層內(nèi)形成皮膚附屬器

移植后4周，實(shí)驗(yàn)組表皮層較厚，分層不明顯，表皮和真皮的連接較為緊密；真皮層纖維排列紊亂、細(xì)胞分布不均勻，未見到毛囊等附屬器(圖8)。與實(shí)驗(yàn)組相比，對照組表皮和真皮的連接較為疏松，表皮和真皮間有間隙，其他鏡下結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)組類似(圖9)。

移植后6周,實(shí)驗(yàn)組真皮層內(nèi)見到與皮膚表面垂直的毛囊樣結(jié)構(gòu)；在同一視野內(nèi)還可見與正常毛囊切面類似的同心圓狀結(jié)構(gòu)；此外還可見皮脂腺結(jié)構(gòu)，大多位于毛囊樣結(jié)構(gòu)周圍，也有單獨(dú)存在(圖10)。對照組真皮層內(nèi)未見毛囊樣結(jié)構(gòu)和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)(圖11)。

移植后8周，實(shí)驗(yàn)組真皮層內(nèi)毛囊樣結(jié)構(gòu)和皮脂腺結(jié)構(gòu)仍然存在，與第6周無明顯差異。而對照組的真皮層內(nèi)仍未見毛囊樣結(jié)構(gòu)和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)。

圖1 類似成纖維細(xì)胞的毛乳頭細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)見羽狀紋理Fig.1Fibroblasts-like dermal papillae cells and penniform texture in cytoplasm

圖2 前3代的細(xì)胞可以相互聚集形成聚集體Fig.2Aggregations formed of the cells of first three passages

圖3 毛乳頭細(xì)胞的標(biāo)志物α-SMA陽性Fig.3Positive expression of α-SMA,the markers of dermal papillae cells

圖4 移植2周后實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合良好Fig.4Wounds had healed in the experiment group,2 weeks after transplantation

圖5 移植2周后對照組創(chuàng)面仍有部分區(qū)域裸露Fig.5Wounds were partly expsured in the control group,2 weeks aftertransplantation

圖6 移植3周后對照組仍未完全愈合Fig.6Wounds had not healed in the control group even 3 weeks after transplantation

圖7 移植4周后對照組創(chuàng)面收縮明顯Fig.7The wounds of control group shrinked more obviously than the experimental group,4 weeks after transplantation

圖8 移植4周后實(shí)驗(yàn)組表皮層和真皮層連接緊密，未見到毛囊等附屬器Fig.8The epidermis and dermis connected tightly and no hair or other appendages were found in the experimental group 4 weeks after transplantation

圖9 移植4周后對照組表皮層和真皮層連接疏松，未見到毛囊等附屬器Fig.9The epidermis and dermis connected loosely and no hair or other appendages were found in the control group 4 weeks after transplantation

圖10 移植6周后實(shí)驗(yàn)組真皮層內(nèi)形成毛囊樣結(jié)構(gòu)和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)Fig.10Some constructions like hair follicles or sebaceous glands were found in the control group 6 weeks after transplantation

圖11 移植后6周對照組真皮層內(nèi)未形成毛囊樣結(jié)構(gòu)和皮脂腺樣結(jié)構(gòu)Fig.11Constructions like hair follicles or sebaceous glands were not found in the experimental group 6 weeks after transplantation

3 討論

皮膚是人體抵御外來侵襲的第一道防線，各種原因?qū)е碌钠つw損傷極為常見。傳統(tǒng)治療大面積全層皮膚損傷的金標(biāo)準(zhǔn)是自體皮膚移植，但自體皮膚移植存在皮源有限和供區(qū)遺留瘢痕等問題。異體皮也是一個較好的選擇，但異體皮來源也受限、并且存在排斥反應(yīng)、疾病傳播、醫(yī)學(xué)倫理等問題。組織工程皮膚為解決上述問題提供了可能的途徑。以往的研究大多把成纖維細(xì)胞種植在真皮層，角質(zhì)形成細(xì)胞種植在表皮層構(gòu)建皮膚替代物，這樣的皮膚替代物沒有任何皮膚附屬器，修復(fù)效果不是很理想[4]。

Oliver等[5]最早發(fā)現(xiàn)毛乳頭對于毛囊的生長是必需的，毛乳頭和毛囊上皮相互作用可以誘導(dǎo)出新的毛囊。1984年，Jahoda等[6]首次利用培養(yǎng)的鼠胡須毛乳頭細(xì)胞和毛囊的上半部分結(jié)合后，在老鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出了新的毛囊-皮脂腺單位。這表明體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞同樣具有誘導(dǎo)毛囊-皮脂腺形成的能力。以后的研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞和其他可以向上皮轉(zhuǎn)化的細(xì)胞混合移植到裸鼠體內(nèi)可以形成毛囊[7-9]。很多研究都已證實(shí)，毛囊形成是毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)干細(xì)胞向毛囊上皮轉(zhuǎn)化的結(jié)果[10-12]。

隨著人們對毛囊形成機(jī)制的深入研究和毛乳頭細(xì)胞在毛囊形成過程當(dāng)中作用的認(rèn)識，有研究用毛乳頭細(xì)胞作為真皮來源細(xì)胞構(gòu)建皮膚替代物[13－14]，但是并沒有得到帶有毛囊結(jié)構(gòu)的皮膚替代物。這可能是因?yàn)闃?gòu)建皮膚替代物時，將毛乳頭細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞分別種植在真皮層和表皮層，由于兩者不能相互作用而未能形成毛囊。本研究中，我們根據(jù)毛囊形成原理，將角質(zhì)形成細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞一起種植在皮膚替代物的真皮層。移植后2周，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面即愈合良好，而對照組需要4周才能完全愈合；另外，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面收縮也較對照組小。有研究報(bào)道，真皮層含有成纖維細(xì)胞或毛乳頭細(xì)胞的皮膚替代物要較真皮層不含有任何細(xì)胞的皮膚替代物的創(chuàng)面愈合能力更強(qiáng)、收縮更少；構(gòu)建的皮膚替代物中，真皮層內(nèi)的毛乳頭細(xì)胞可以通過分泌IGFBP-2促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和維持表皮干細(xì)胞的特性[14]。Qi等[15]將毛乳頭細(xì)胞種植到去細(xì)胞真皮上，再在表面種上表皮干細(xì)胞形成復(fù)合皮膚替代物，移植后3周表皮層較無毛乳頭細(xì)胞的去細(xì)胞真皮組更厚，這也提示毛乳頭細(xì)胞可以促進(jìn)表皮細(xì)胞的分層。但是，在我們的研究中，實(shí)驗(yàn)組和對照組表皮層厚度并沒有明顯差別。這可能是因?yàn)楸砥雍穸鹊牟町愔饕求w外培養(yǎng)階段產(chǎn)生的，移植之后由于微環(huán)境接近正常，毛乳頭細(xì)胞促進(jìn)表皮層生長的作用變的相對不明顯。而我們的研究中，體外培養(yǎng)時間非常短，所以表皮層厚度的差異并不突出。

本研究發(fā)現(xiàn)，移植后6周實(shí)驗(yàn)組真皮層內(nèi)可見到毛囊樣結(jié)構(gòu)，對照組未形成類似結(jié)構(gòu)，證明了毛乳頭細(xì)胞和表皮細(xì)胞不僅以細(xì)胞懸液形式移植到動物體內(nèi)后可以相互作用[8，16]，而且在Ⅰ型膠原蛋白里也可以相互作用，和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果一致[17]。但新形成的毛囊樣結(jié)構(gòu)與正常毛囊結(jié)構(gòu)存在一定差異，正常毛囊結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而我們得到的毛囊結(jié)構(gòu)多為較簡單的細(xì)胞聚集，沒有形成進(jìn)一步的分化。皮脂腺形成過程和毛發(fā)的形成過程類似，都是由毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。在實(shí)驗(yàn)組中也發(fā)現(xiàn)了大量皮脂腺結(jié)構(gòu)，它們與正常皮脂腺結(jié)構(gòu)相似，但它們與毛囊的連接并不像正常毛囊那樣緊密，有的甚至單獨(dú)存在。

綜上所述，構(gòu)建帶毛囊的組織工程皮膚替代物，必須將毛乳頭細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞一起種植在皮膚替代物的真皮層，從而使兩種細(xì)胞相互作用而形成毛囊-皮脂腺結(jié)構(gòu)。構(gòu)建的帶毛囊-皮脂腺結(jié)構(gòu)的皮膚替代物，創(chuàng)面修復(fù)能力強(qiáng)，并且可減少創(chuàng)面收縮。

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