鄒慧儒 YANG Xuebin Steven Brookes 秦宗長(zhǎng) 楊 敏 何淑萍 辛 宇 張?zhí)m成

不同年齡段牙髓組織比例及牙髓干細(xì)胞分布的實(shí)驗(yàn)研究

鄒慧儒 YANG Xuebin Steven Brookes 秦宗長(zhǎng) 楊 敏 何淑萍 辛 宇 張?zhí)m成

目的 通過(guò)觀察不同年齡段前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齒的比例，及干細(xì)胞分布情況，評(píng)估牙齒組織工程臨床適宜的選材標(biāo)本。方法 臨床收集不同年齡段因正畸或其他原因拔除的無(wú)齲壞、無(wú)牙周疾病等的健康前磨牙及第三磨牙，分別稱重牙齒及牙髓并計(jì)算比例。掃描電鏡觀察牙髓表面形態(tài)。脫鈣后病理切片觀察，牙髓組織內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞層完整與否，觀察細(xì)胞與纖維成分比例；阿爾新藍(lán)－希爾紅染色，偏振光顯微鏡觀察有無(wú)雙折射現(xiàn)象；免疫組化染色觀察，間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物STRO-1以及成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白牙本質(zhì)涎蛋白DSP的表達(dá)情況，評(píng)估牙髓干細(xì)胞在牙髓組織中的分布情況。結(jié)果 隨著年齡的增長(zhǎng)，前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齒比例逐漸縮小，11～20歲年齡段與31～40歲、41～50歲，以及50歲以上年齡段比較，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。掃描電鏡下可見(jiàn)摘除的牙髓組織類(lèi)似樹(shù)樁，有些區(qū)域比較平滑，有些區(qū)域表面有不規(guī)則突起。牙髓組織內(nèi)存在雙折射。STRO-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞在牙髓組織中散在分布，在血管周?chē)^密集。DSP表達(dá)則主要集中在牙本質(zhì)區(qū)域及成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，牙髓內(nèi)僅有少量表達(dá)。結(jié)論 隨著年齡的增長(zhǎng)，牙髓逐漸萎縮，牙髓干細(xì)胞的分布集中于血管周?chē)谘浪杞M織內(nèi)散在分布，未分化的牙髓干細(xì)胞不表達(dá)成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白DSP。

人牙髓組織 牙髓干細(xì)胞 分布 STRO-1 牙本質(zhì)涎蛋白

牙髓干細(xì)胞 （Dental pulp stem cells，DPSCs）是一組在乳牙和恒牙牙髓中都存在的成體干細(xì)胞(Adult stem cells，ASCs)。研究表明，牙髓干細(xì)胞可以分化成骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)，以及形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體等，可以作為機(jī)體多個(gè)臟器或組織再生所需的組織工程種子細(xì)胞來(lái)源[1-4]。牙髓內(nèi)廣泛存在著牙髓干細(xì)胞，但是牙髓干細(xì)胞在不同年齡段的牙髓內(nèi)的分布情況尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在收集不同年齡段的健康前磨牙及第三磨牙，采集牙髓組織，測(cè)算牙髓占牙齒比例，觀察牙髓組織形態(tài)、細(xì)胞及纖維構(gòu)成，通過(guò)檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物STRO-1和成牙本質(zhì)細(xì)胞相關(guān)蛋白牙本質(zhì)涎蛋白 （Dentine sialoprotein，DSP）的表達(dá)，檢測(cè)在不同年齡段的牙髓組織內(nèi)牙髓干細(xì)胞的分布情況。

1 材料和方法

1.1 材料

利茲大學(xué)口腔醫(yī)院及天津市口腔醫(yī)院口腔外科門(mén)診因正畸或其他原因拔除的健康前磨牙及第三磨牙的新鮮標(biāo)本。

1.2 主要試劑和儀器

STRO-1、DSP鼠抗人單克隆抗體（SantaCruz，USA）及免疫組化染色試劑盒（EnVision System，Japan）；電子稱重儀、組織切片機(jī)、偏振光顯微鏡、掃描電子顯微鏡。

1.3 牙髓占牙齒比例測(cè)定

收集不同年齡段 （11～20歲、21～30歲、31～40歲、41～50歲，以及50歲以上）因正畸或其他原因拔除的無(wú)齲壞、無(wú)牙周疾病等的健康前磨牙或第三磨牙，清理干凈牙齒表面污穢以及頸部牙齦或根面牙周膜附著之后，稱重牙齒并記錄，打開(kāi)髓腔取出牙髓稱重記錄。分別稱取3次，記錄平均值，并計(jì)算牙髓占牙齒比例。匯總結(jié)果，對(duì)不同年齡段牙髓占牙齒比例進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 掃描電鏡觀察

牙齒離體后立即用生理鹽水清洗，打開(kāi)髓腔取出牙髓，10%中性福爾馬林液固定24 h；50%～100%乙醇系列脫水：50%乙醇30 min，60%乙醇30 min，70%乙醇30 min，80%乙醇30 min，90%乙醇30 min，100%乙醇3次，每次30 min，空氣干燥過(guò)夜；噴金鍍膜，掃描電鏡觀察牙髓表面超微形態(tài)。

1.5 組織學(xué)觀察

牙齒離體后生理鹽水清洗，10%中性福爾馬林液固定24 h；14%EDTA（pH7.0）脫鈣2～3個(gè)月，X線片證實(shí)牙齒組織脫鈣完全；50%～100%乙醇系列脫水（同前），之后浸入二甲苯2次，每次60 min；石蠟浸潤(rùn)2次，每次60 min；石蠟包埋，切片（厚度4 μm），HE染色，觀察牙髓組織內(nèi)成牙本質(zhì)細(xì)胞層完整與否、細(xì)胞與纖維構(gòu)成情況；阿爾新藍(lán)－希爾紅染色，偏振光顯微鏡觀察有無(wú)雙折射現(xiàn)象。

1.6 免疫組化染色

牙齒標(biāo)本切片烘干，脫蠟，蒸餾水洗2次，2%辣根過(guò)氧化物酶作用20 min，PBS洗5 min，高壓鍋法暴露抗原，5%羊血清封閉20 min，PBS洗5 min，加入一抗STRO-1(1∶200)，DSP（1∶400）孵育1 h，PBS洗5 min，采用EnVision System。EnVision A液30 min，PBS洗5 min，EnVision B+C液5 min，觀察顯色反應(yīng)。清水沖洗，蘇木素復(fù)染2 min，DPX封片，顯微鏡下觀察STRO-1及DSP表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 牙髓占牙齒比例

不同年齡段牙髓占牙齒比例由1.056%～4.826%不等，其中11～20歲第三磨牙牙髓占牙齒比例最高，為（4.826±0.017）%；50歲以上年齡段前磨牙牙髓占牙齒比例最低，為（1.056±0.044）%。對(duì)不同年齡段前磨牙及第三磨牙分組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，11～20歲與21～30歲年齡段前磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＞0.05；11～20歲與31歲之后的各年齡段前磨牙牙髓占牙齒比例相比，P＜0.001；11～20歲與21～30歲第三磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＜0.01；11～20歲與31歲之后的各年齡段第三磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＜0.001。隨著年齡的增加，牙髓占牙齒比例逐漸減少，但是40～50歲與50歲以上前磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＞0.05，40～50歲與 50歲以上第三磨牙牙髓占牙齒比例比較，P＜0.05（圖1）。

2.2 掃描電鏡觀察

掃描電鏡觀察可見(jiàn)，部分牙髓類(lèi)似樹(shù)樁，有些區(qū)域比較平滑，有些區(qū)域表面有不規(guī)則突起，可能是成牙本質(zhì)細(xì)胞突起的近髓斷端；還可以觀察到細(xì)長(zhǎng)的管狀結(jié)構(gòu)疑似牙髓細(xì)小分支（圖2）。

2.3 牙髓組織學(xué)觀察

HE染色可見(jiàn)冠部牙髓殘留成牙本質(zhì)細(xì)胞，但是成牙本質(zhì)細(xì)胞突起不完全（圖3）。冠方牙髓組織中細(xì)胞成分較多，纖維成分較少；根部牙髓組織中細(xì)胞成分較少，纖維成分較多。阿爾新藍(lán)－希爾紅染色示牙本質(zhì)呈紅色，成牙本質(zhì)細(xì)胞層及部分牙髓組織呈藍(lán)色，部分牙髓呈纖維結(jié)構(gòu)，呈紅色。偏振光顯微鏡可見(jiàn)牙本質(zhì)及部分牙髓呈雙折射現(xiàn)象（圖4）。

圖1 不同年齡段前磨牙及第三磨牙牙髓占牙齒比例（＊＊：P＜0.01；＊＊＊：P＜0.001）Fig.1 Dental pulp/tooth ratio of premolars and third molars from different age groups(**:P＜0.01;***:P＜0.001)

圖2 掃描電鏡下摘除的牙髓表面形態(tài)（標(biāo)尺：200 μm）Fig.2 The surface morphology of the extracted dental pulp tissue(scale bar:200 μm)

圖3 冠方及根部牙髓組織（HE染色，200×）Fig.3 Coronal and radical pulp tissues(HE staining,200×)

圖4 牙髓組織偏振光顯微鏡下觀察(阿爾新藍(lán)-希爾紅染色，200×)Fig.3 Dental pulp tissue observation under the polarized light microscope(Alcian blue/Sirus red staining,200×)

2.4 牙髓干細(xì)胞的分布

STRO-1陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞在牙髓組織中散在分布，在血管周?chē)^密集，提示近血管周?chē)嬖谳^多的干細(xì)胞。DSP表達(dá)則主要集中在牙本質(zhì)區(qū)域及成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，牙髓內(nèi)僅有少量表達(dá)（圖5）。

3 討論

牙髓位于由牙本質(zhì)圍成的牙髓腔內(nèi)，由細(xì)胞、細(xì)胞間質(zhì)和細(xì)胞間液組成。牙髓的細(xì)胞成分包括成牙本質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和防御細(xì)胞等。2000年，Gronthos等[5]首次體外成功分離培養(yǎng)了人牙髓干細(xì)胞，提示牙髓組織中還存在保持未分化狀態(tài)的成體干細(xì)胞，這些細(xì)胞具有高度增殖分化潛能。相對(duì)于胚胎干細(xì)胞的研究，成體干細(xì)胞研究不涉及相關(guān)倫理問(wèn)題及取材限制等，可以取自患者，經(jīng)誘導(dǎo)分化后再移植回患者體內(nèi)，不存在免疫排斥問(wèn)題[6-8]。因此，成體干細(xì)胞的研究具有廣闊前景。但是，隨著供體年齡的增長(zhǎng)，成體干細(xì)胞是否存在數(shù)量及活性上的變化，是否影響到將來(lái)臨床應(yīng)用的效果，這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)收集了門(mén)診因正畸或其他原因拔除的健康前磨牙及第三磨牙，并按照年齡段分組，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，50歲以上年齡段牙髓占牙齒比例很小，這可能是因?yàn)殡S著年齡增長(zhǎng)，繼發(fā)性牙本質(zhì)不斷形成，牙髓腔逐漸變小。該結(jié)果提示取年輕患者的牙齒供體可以獲得較多的牙髓組織。

在許多組織中，成體干細(xì)胞與組織前體細(xì)胞常常難以區(qū)分。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，在牙髓組織中，成體干細(xì)胞，即牙髓干細(xì)胞，可以生成該組織所有的分化細(xì)胞類(lèi)型，包括成牙本質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、防御細(xì)胞等；而前體細(xì)胞只能分化成特定的功能細(xì)胞[9]。目前的技術(shù)手段還不能準(zhǔn)確地鑒別成體干細(xì)胞和前體細(xì)胞。形態(tài)學(xué)上，牙髓干細(xì)胞比較小，有不明顯的胞漿突，通常位于小血管及毛細(xì)血管周?chē)鶾10]。在牙髓干細(xì)胞的研究過(guò)程中，STRO-1常被視為牙髓干細(xì)胞未分化的標(biāo)記物，而DSP常常作為成牙本質(zhì)細(xì)胞分化的特異分子標(biāo)記物[11-14]。有研究結(jié)果表明，在未經(jīng)誘導(dǎo)的牙髓干細(xì)胞中，DSP只有少量弱陽(yáng)性表達(dá)，誘導(dǎo)其向成牙本質(zhì)細(xì)胞方向分化以后，可以出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)[15]。D’Souza等[16]證實(shí)，DSP出現(xiàn)于牙本質(zhì)礦化前的年輕成牙本質(zhì)細(xì)胞中，與早期分泌的前期牙本質(zhì)伴隨出現(xiàn)；DSP在成熟的前期牙本質(zhì)中表達(dá)增多，而在牙本質(zhì)形成過(guò)程中，牙髓基質(zhì)以及其他組織和細(xì)胞中則不表達(dá)。盡管近些年來(lái)有些學(xué)者在骨、軟骨等組織提取物中檢測(cè)到DSP的存在，表明這些組織中也有少量的DSP表達(dá)，但是表達(dá)水平與在牙本質(zhì)中相比是極其微量的[17-19]。因此，目前仍然將DSP作為成牙本質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物來(lái)進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中，STRO-1表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞主要集中在牙髓組織血管周?chē)?；而DSP表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞主要是成牙本質(zhì)細(xì)胞，以及近成牙本質(zhì)細(xì)胞層區(qū)域的牙髓組織。STRO-1陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)DSP，而DSP陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)STRO-1，這一結(jié)果也驗(yàn)證了STRO-1表達(dá)陽(yáng)性代表的牙髓干細(xì)胞與DSP表達(dá)陽(yáng)性代表的成牙本質(zhì)細(xì)胞或成牙本質(zhì)前體細(xì)胞在牙髓組織中的分布情況。

對(duì)牙髓干細(xì)胞在牙髓組織中的分布一直存在著不同的認(rèn)識(shí)，有研究比較了人牙冠髓與根髓培養(yǎng)細(xì)胞的特性，從培養(yǎng)成功率、細(xì)胞貼壁率、細(xì)胞活性、增殖特性、細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞誘導(dǎo)礦化能力等多方面探討了牙髓干細(xì)胞在牙髓組織中的定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)的根髓細(xì)胞相比冠髓細(xì)胞具有較高的成功率及貼壁率，較強(qiáng)的細(xì)胞活性，以及相同的增殖活性；根髓細(xì)胞相比冠髓細(xì)胞，形態(tài)更具有原始性，更易誘導(dǎo)礦化[9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)冠髓細(xì)胞排列疏松錯(cuò)落，根髓細(xì)胞排列條理有序，在組織形態(tài)上顯示出差異。冠髓殘留有成牙本質(zhì)細(xì)胞，但是該成牙本質(zhì)細(xì)胞不完全，細(xì)長(zhǎng)的成牙本質(zhì)細(xì)胞突起部分缺失，通過(guò)掃描電鏡及組織學(xué)染色先后得到證實(shí)。牙髓某些區(qū)域偏振光顯微鏡下呈現(xiàn)雙折射現(xiàn)象，而某些區(qū)域則沒(méi)有雙折射現(xiàn)象，提示牙髓組織結(jié)構(gòu)性質(zhì)不均一。今后需要繼續(xù)深入研究牙髓組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及細(xì)胞的功能與活性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)STRO-1及DSP在牙髓組織內(nèi)的表達(dá)，為牙齒組織工程供體研究提供了牙髓組織及牙髓干細(xì)胞分布等相關(guān)信息，為供體選擇提供了一定的依據(jù)，具有積極的理論意義和潛在的臨床參考價(jià)值。

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Experimental Study on Dental Pulp Tissue Proportion and Stem Cell Distribution of Dental Pulp Tissue in Different Age Groups

ZOU Huiru1,2,YANG Xuebin2,Steven Brookes2,QIN Zongchang1,YANG Min1,HE Shuping1,XIN Yu1, ZHANG Lancheng1.1 Tianjin Stomatological Hospital,Nankai University,Tianjin 300041,China;2.Leeds Dental Institute, University of Leeds,Leeds LS2 9LU,UK.Corresponding author:ZHANG Lancheng(E-mail:lenchong_zhong@sina.com.cn).

Objective To investigate the pulp/tooth ratio and distribution of stem cells of dental pulp tissue in premolars and third molars from different age groups and assess the selection of clinical specimens for dental tissue engineering. Methods Healthy premolars and third molars of different ages were collected during removal due to orthodontic or other reasons.Both the teeth and pulp tissues were weighed and dental pulp/tooth ratio were calculated.The surface morphology of the extracted dental pulp tissue was observed under SEM.After fixed and decalcified,premolars and third molars were embedded and cut for HE staining.Then the slides were observed under the microscope to check the integrity of odontoblast cell layer and the cell/fiber distribution.Alcian blue/Sirus red staining was used and slides were observed under the polarized light microscope to check birefringence.Immunohistochemical staining was used to observe specific mesenchymal stem cell markers STRO-1 and dentin sialoprotein-DSP expression to assess the distribution of dental pulp stem cells in dental pulp tissue.Results The pulp/tooth ratio was gradually reduced with age.SEM showed the “stump-like”pulp tissue with relatively smooth in some regions and irregular protrusions in other regions.There were birefringence in the pulp tissue. STRO-1 positive cells were scattered in dental pulp tissue,and concentrated around blood vessels.DSP expression was mainly concentrated in the region of dentin and odontoblasts.Conclusion The pulp tissue shrinks with age.Dental pulpstem cells are scattered in the pulp tissue and distributed mainly around the blood vessels.Undifferentiated dental pulp stem cells do not express odontoblast-related.

Human dental pulp tissue;Dental pulp stem cells;Distribution;STRO-1;Dentin sialoprotein

Q813.1+1

A

1673－0364（2011）06－0306－05

2011年9月5日；

2011年10月12日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.06.002

300041 天津市 南開(kāi)大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，天津市口腔醫(yī)院（鄒慧儒，秦宗長(zhǎng)，楊敏，何淑萍，辛宇，張?zhí)m成）；Leeds Dental Institute,University of Leeds,Leeds LS2 9LU,UK.（利茲大學(xué)口腔研究所）（鄒慧儒，YANG Xuebin，Steven Brookes）。

張?zhí)m成（E-mail：lenchong_zhong@sina.com.cn）。