錢(qián)玉鑫 蘆立軒 侯強(qiáng) 江華 張文俊 劉安堂

爆炸傷導(dǎo)致軟組織缺損嚴(yán)重，傷道周?chē)吧蠲娲嬗心嗌?、爆炸物碎屑、毛發(fā)等異物，清創(chuàng)后感染發(fā)生率高[1]；爆炸傷患者嚴(yán)重創(chuàng)傷后免疫反應(yīng)受到抑制，容易出現(xiàn)嚴(yán)重感染及其他并發(fā)癥[2]。負(fù)壓創(chuàng)面治療技術(shù)(NPWT)自上世紀(jì)90年代以來(lái)，已被證實(shí)具有較強(qiáng)的預(yù)防和控制感染能力，并能促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)。本研究通過(guò)動(dòng)態(tài)觀(guān)察組織內(nèi)細(xì)菌量及組織學(xué)觀(guān)察肉芽生長(zhǎng)情況，探討NPWT早期應(yīng)用對(duì)于控制軟組織爆炸傷創(chuàng)面感染及促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

健康家豬(n=5)，第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量30～35 Kg，雌雄不限；NPWT敷料由醫(yī)用聚氨酯海綿(孔徑400～600 μm，厚度2 cm，大小10 cm×15 cm)、三通接頭(GL-200)、引流管醫(yī)用貼膜(3M)、負(fù)壓泵(YB-DX230型電動(dòng)吸引器，上海醫(yī)療器械工業(yè)公司)構(gòu)成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豬軟組織爆炸傷模型建立

采用兩根600 mg瞬發(fā)紙質(zhì)電雷管并列致傷，間距2 cm。皮膚與爆炸源之間墊放0.5 cm厚海綿，固定后人員撤離，電起爆致傷。致傷部位選擇肌肉豐滿(mǎn)處，臀部致傷位置為髂前上棘后側(cè)4 cm，肩胛部致傷位置距背中線(xiàn)10 cm。每只動(dòng)物致傷4個(gè)部位(雙側(cè)臀部和雙側(cè)肩胛部)，每次致傷1個(gè)部位。

1.2.2 動(dòng)物清創(chuàng)治療及分組

3只家豬隨機(jī)分為一側(cè)NPWT組，對(duì)側(cè)為紗布敷料組，每組6個(gè)創(chuàng)面；另選取兩只家豬形成的6個(gè)創(chuàng)面設(shè)為暴露組。致傷后6 h，暴露組送回動(dòng)物房固定飼養(yǎng)，NPWT組及紗布敷料組行創(chuàng)面清創(chuàng)。去除表面壞死組織，搔刮至組織新鮮出血。雙氧水、洗必泰、生理鹽水沖洗創(chuàng)面，消毒創(chuàng)面周?chē)Ｆつw。按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行創(chuàng)面包扎。紗布組:外層凡士林紗布、內(nèi)層無(wú)菌干紗布覆蓋，并將紗布固定于周?chē)つw。NPWT組:制備、安放NPWT敷料，調(diào)節(jié)負(fù)壓至-125 mmHg，檢查貼膜的氣密性。

1.2.3 大體觀(guān)察

觀(guān)察創(chuàng)面色澤、腫脹情況、分泌物的顏色及數(shù)量，并拍照留檔。

1.2.4 組織學(xué)觀(guān)察

傷后6 h和治療后第3、5、7天，自創(chuàng)面中心取10 mm×10 mm×10 mm大小組織塊,福爾馬林固定，石蠟包埋，5 μm厚度制片，常規(guī)HE染色，顯微鏡觀(guān)察組織損傷、炎癥浸潤(rùn)及肉芽生長(zhǎng)情況。

1.2.5 創(chuàng)面組織細(xì)菌計(jì)數(shù)

傷后6 h和治療后第3、5、7天取材。取材前生理鹽水紗布擦拭創(chuàng)面，除去滲液及壞死組織，以無(wú)菌方法取創(chuàng)面中央組織，大小約2 mm×2 mm×2 mm，稱(chēng)重后玻璃勻漿器制成1.0 mL的勻漿液，按l:l0進(jìn)行不同比例稀釋?zhuān)诟魈荻热?.5 mL標(biāo)本稀釋液接種于瓊脂平板上，37℃孵育24 h，計(jì)數(shù)平板上的細(xì)菌菌落。每克組織內(nèi)的細(xì)菌數(shù)=菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)/標(biāo)本重量，單位cfu/g(cfu:colony-forming unit，菌落形成單位)。

1.2.6 動(dòng)物飼養(yǎng)

清創(chuàng)后動(dòng)物自制五孔板固定籠內(nèi)飼養(yǎng)。每日肌注青霉素40 000 U/Kg。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面大體觀(guān)察

傷后第3天:NPWT組局部可見(jiàn)新生肉芽組織，創(chuàng)面濕潤(rùn)，分泌物少(圖1A)。紗布組組織水腫，創(chuàng)面基底凹凸不平，創(chuàng)面可見(jiàn)壞死肌肉組織，表面少量膿性分泌物(圖1B)。暴露組創(chuàng)周紅腫明顯，創(chuàng)面內(nèi)滲液，異味明顯；創(chuàng)緣可見(jiàn)1～2 cm皮緣發(fā)黑，呈燒灼樣損傷；創(chuàng)面基底局部肌肉外露，質(zhì)軟色暗紅，夾之不收縮，切割不出血(圖1C)。

傷后第5天:NPWT組創(chuàng)面肉芽新鮮，色紅，稍水腫，觸之易出血(圖2A)。紗布組創(chuàng)面深度較前稍加深，局部肌肉組織壞死，少部分肉芽生長(zhǎng)，蒼白水腫(圖2B)。暴露組創(chuàng)面較前擴(kuò)大，痂皮未見(jiàn)溶解；創(chuàng)面滲液多，異味明顯，創(chuàng)周紅腫(圖2C)。

傷后第7天:NPWT組滲液少，創(chuàng)面內(nèi)肉芽致密，組織無(wú)明顯水腫(圖3A)。紗布組肉芽面積較前稍增大，滲液較第5天減少(圖3B)。暴露組局部痂皮溶解，下方可見(jiàn)少量肉芽組織，水腫質(zhì)脆，表面有膿性分泌物，量多伴惡臭，創(chuàng)緣紅腫(圖3C)。

2.2 創(chuàng)面組織細(xì)菌計(jì)數(shù)

傷后第3天:NPWT組可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生，細(xì)胞水腫減退(圖4A)。紗布組可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯，肌細(xì)胞間有少量成纖維細(xì)胞增生(圖4B)。暴露組可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分肌纖維出現(xiàn)溶解壞死(圖4C)。

傷后第5天:NPWT組新生肉芽鮮紅，成纖維細(xì)胞增多，可見(jiàn)新生的微毛細(xì)血管(圖5A)。紗布組炎性浸潤(rùn)明顯，肌細(xì)胞周?chē)^多成纖維細(xì)胞，未見(jiàn)微毛細(xì)血管形成，無(wú)明顯肉芽生長(zhǎng)(圖5B)。暴露組組織水腫明顯，肌細(xì)胞碎裂溶解，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5C)。

傷后第7天:NPWT組肉芽組織致密，炎性細(xì)胞少，可見(jiàn)成形血管(圖6A)。紗布組肉芽組織疏松，可見(jiàn)微毛細(xì)血管形成(圖6B)。暴露組大片肌細(xì)胞溶解壞死，呈空泡狀，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，炎癥明顯(圖6C)。

2.3 創(chuàng)面組織細(xì)菌計(jì)數(shù)

治療前各組間細(xì)菌數(shù)無(wú)明顯差異。治療后各時(shí)間段NPWT組細(xì)菌計(jì)數(shù)均較紗布組、暴露組數(shù)值小，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著(表1)。NPWT治療后第3天后計(jì)數(shù)為(3.282±0.336)×105cfu/g，以后隨時(shí)間延長(zhǎng)計(jì)數(shù)不再增加；第5天細(xì)菌計(jì)數(shù)降至感染臨界水平以下。紗布組第5天細(xì)菌計(jì)數(shù)達(dá)到峰值，后緩慢下降。暴露組細(xì)菌計(jì)數(shù)逐漸增高，第7天達(dá)到109cfu/g水平，感染嚴(yán)重(圖7)。

圖1 治療后第3天創(chuàng)面大體觀(guān)Fig.1The gross observation 3 days after treatment

圖2 治療后第5天創(chuàng)面大體觀(guān)Fig.2The gross observation 5 days after treatment

圖3 治療后第7天創(chuàng)面大體觀(guān)Fig.3The gross observation 7 days after treatment

圖4 治療后第3天創(chuàng)面組織HE染色(400×)Fig.4HE staining observation 3 days after treatment(400×)

圖5 治療后第5天創(chuàng)面組織HE染色(200×)Fig.5HE staining observation 5 days after treatment(200×)

圖6 治療后第7天創(chuàng)面組織HE染色(200×)Fig.6HE staining observation 7 days after treatment(200×)

圖7 創(chuàng)面組織細(xì)菌計(jì)數(shù)Fig.7Wound organization bacterial count

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)菌計(jì)數(shù)(±s，×105cfu/g)Table 1Bacterial counts of specimens from each group at different time points(±s，×105cfu/g)

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)菌計(jì)數(shù)(±s，×105cfu/g)Table 1Bacterial counts of specimens from each group at different time points(±s，×105cfu/g)

NPWT group(n=6)Gauze group(n=6)Exposure group(n=6)6 hours0.095±0.0150.101±0.0170.102±0.015 3 days after treatment3.282±0.33652.320±5.362268.263±28.416 5 days after treatment0.539±0.07593.457±7.4041 479.266±142.044 7 days after treatment0.096±0.02146.621±4.49110 197.759±941.823

3 討論

上世紀(jì)50年代開(kāi)始，細(xì)菌計(jì)數(shù)被認(rèn)為能直觀(guān)并準(zhǔn)確地反映創(chuàng)面感染程度，并進(jìn)而預(yù)測(cè)組織愈合情況。細(xì)菌計(jì)數(shù)達(dá)到105cfu/g被視為是感染的臨界值[3]。爆炸傷組織損傷嚴(yán)重，創(chuàng)面缺乏正常皮膚的屏障作用，水、蛋白質(zhì)丟失，創(chuàng)面細(xì)菌感染率較高?？刂聘腥居?個(gè)主要手段:清創(chuàng)、創(chuàng)面沖洗、特異性抗生素應(yīng)用。自NPWT發(fā)明以來(lái)，大量研究發(fā)現(xiàn)，NPWT治療可以降低細(xì)菌負(fù)荷[4-5]。也有部分研究觀(guān)察到治療過(guò)程中細(xì)菌計(jì)數(shù)升高，但創(chuàng)面臨床情況改善[6]。針對(duì)這種傷口愈合而細(xì)菌負(fù)荷并未降低的現(xiàn)象，Moues等[7]推測(cè)，相對(duì)于細(xì)菌的數(shù)目而言，細(xì)菌的種類(lèi)、性質(zhì)、毒力以及機(jī)體對(duì)抗感染的能力更為重要。美軍已經(jīng)逐漸將NPWT運(yùn)用到戰(zhàn)傷救治中，將創(chuàng)面與周?chē)鷳?zhàn)場(chǎng)、病室環(huán)境相隔離，有效保持創(chuàng)面清潔并減少創(chuàng)面感染。Leininger等[8]運(yùn)用NPWT治療88例高能爆炸所致軟組織創(chuàng)面，無(wú)創(chuàng)面感染及并發(fā)癥發(fā)生。Geiger等[9]對(duì)合并廣泛軟組織和骨質(zhì)缺損(Ⅲ/Ⅳ級(jí)開(kāi)放性骨折)的68名伊戰(zhàn)傷員，運(yùn)用NPWT進(jìn)行創(chuàng)面準(zhǔn)備，減少了急、慢性骨髓炎的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)顯示，NPWT早期治療爆炸傷創(chuàng)面，能抑制細(xì)菌增殖，降低組織細(xì)菌負(fù)荷。各時(shí)間段NPWT組細(xì)菌計(jì)數(shù)均較紗布組、暴露組數(shù)值小。NPWT組治療后第3天后計(jì)數(shù)為(3.282±0.336)×105cfu/g，后隨時(shí)間延長(zhǎng)，計(jì)數(shù)不再增加；第5天細(xì)菌計(jì)數(shù)降至感染臨界值水平以下。NPWT早期治療，能有效控制爆炸傷創(chuàng)面細(xì)菌增殖的作用機(jī)制，其可能機(jī)制是:①貼膜的屏障作用，NPWT使創(chuàng)面與周?chē)h(huán)境相隔離，有效保持創(chuàng)面清潔并減少創(chuàng)面感染。與平原地區(qū)相比，高原環(huán)境下細(xì)菌增殖速度減緩，細(xì)菌計(jì)數(shù)達(dá)到107cfu/g時(shí)才出現(xiàn)感染，可能與低氧環(huán)境有關(guān)[10]。②負(fù)壓的虹吸作用將細(xì)菌、滲液及壞死物質(zhì)從創(chuàng)面清除，組織細(xì)菌量減少，減少條件性致病菌增殖[11]。負(fù)壓產(chǎn)生的吸引力量減少了細(xì)菌向深面組織的侵襲，抑制了感染擴(kuò)散。③減少第三間隙內(nèi)液體，減輕創(chuàng)面水腫。軟組織爆炸傷損傷嚴(yán)重，壞死物質(zhì)及滲出多，組織水腫明顯，循環(huán)阻塞引起細(xì)胞持續(xù)性壞死及組織繼發(fā)性感染。NPWT治療有效減輕組織水腫，縮短毛細(xì)血管與修復(fù)細(xì)胞之間的距離，增加氧和營(yíng)養(yǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)，白細(xì)胞更容易外滲到達(dá)微生物定殖區(qū)域，提高了組織的抗感染能力[12]。④NPWT治療后，組織細(xì)菌負(fù)荷減輕，避免了過(guò)度炎癥反應(yīng)。適度的炎癥促使創(chuàng)面自炎癥期轉(zhuǎn)入為增殖期變化，肉芽組織形成，創(chuàng)周上皮組織向創(chuàng)面內(nèi)遷移，增強(qiáng)了創(chuàng)面的屏障作用。

伊拉克戰(zhàn)爭(zhēng)中，美軍已廣泛應(yīng)用NPWT早期治療皮膚軟組織戰(zhàn)創(chuàng)傷，文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用后可以減輕醫(yī)護(hù)人員工作量，提高治療效果。Morykwas等[5]證實(shí)，與濕紗布敷料相比，應(yīng)用NPWT治療家豬創(chuàng)面肉芽形成的體積可以增加約60%；進(jìn)一步的研究表明，負(fù)壓在125 mmHg時(shí)肉芽生長(zhǎng)效果較25 mmHg或500 mmHg要好[13]。本研究通過(guò)觀(guān)察爆炸傷創(chuàng)面肉芽生長(zhǎng)的情況，發(fā)現(xiàn)NPWT組肉芽形成較其他兩組更早。治療后第3天，NPWT鏡下即表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞增生，水腫明顯減輕；第5天時(shí)NPWT組新生肉芽鮮紅，并可以見(jiàn)多個(gè)微毛細(xì)血管形成，而紗布組僅有少量肉芽生長(zhǎng)；第7天時(shí)NPWT組肉芽組織致密，成形血管形成。NPWT早期治療促進(jìn)肉芽生長(zhǎng)的作用，可能與以下因素有關(guān):①負(fù)壓作用減輕組織水腫，改善創(chuàng)面的供血、供氧，負(fù)壓治療后組織氧含量上升，增強(qiáng)細(xì)胞分化能力，并且提高成纖維細(xì)胞的增殖和遷移，調(diào)控膠原生成。②負(fù)壓吸引的機(jī)械性牽張作用。細(xì)胞受到表面張力才能響應(yīng)細(xì)胞因子變化發(fā)生分裂和增殖；未受牽拉時(shí)，細(xì)胞外形呈球狀，細(xì)胞周期停止，并出現(xiàn)凋亡趨勢(shì)[14]。NPWT導(dǎo)致創(chuàng)面微變形，這種變化使細(xì)胞骨架中細(xì)胞整合素發(fā)生斷裂，觸發(fā)了細(xì)胞內(nèi)第二信使的釋放(如前列腺素，磷酸肌醇，蛋白激酶C，細(xì)胞內(nèi)鈣)，引起細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和分化[15]。負(fù)壓張力作用下，細(xì)胞伸展5%～20%時(shí)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖[15]，毛細(xì)血管芽定向生長(zhǎng)。③負(fù)壓吸引促進(jìn)創(chuàng)面內(nèi)修復(fù)性生長(zhǎng)因子分泌，降低創(chuàng)面內(nèi)抑制性因子水平。NPWT能夠提高創(chuàng)面組織內(nèi)VEGF、FGF-2以及PDGF的表達(dá)[16]。VEGF、FGF-2已被證實(shí)是最強(qiáng)的血管新生刺激因子，VEGF主要促進(jìn)毛細(xì)血管形成，F(xiàn)GF-2則傾向于促進(jìn)小動(dòng)脈形成。兩者在血管新生的不同階段起作用，共同作用可以更好地促進(jìn)血管新生。FGF-2、PDGF均具有趨化及增殖作用，促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)。同時(shí)，負(fù)壓作用可將抑制成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的多種細(xì)胞因子、金屬蛋白酶以及膠原酶，從創(chuàng)面中引流清除，從而使修復(fù)性生長(zhǎng)因子更好地發(fā)揮作用。④控制感染，促進(jìn)組織由炎癥期向增殖期轉(zhuǎn)變。感染可延長(zhǎng)炎癥反應(yīng)期，妨礙肉芽組織形成。

NPWT早期應(yīng)用治療豬爆炸傷軟組織缺損，能有效抑制創(chuàng)面細(xì)菌增殖，減輕細(xì)菌負(fù)荷，避免創(chuàng)面過(guò)度炎癥反應(yīng)；并可早期啟動(dòng)爆炸傷軟組織創(chuàng)面細(xì)胞增殖過(guò)程，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)。因此，在爆炸傷傷軟組織缺損創(chuàng)面的早期治療中具有積極的意義。

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