歐陽(yáng)慧子，任曉亮，王 強(qiáng)，王貴芳，趙 敏，戚愛(ài)棣

中藥何首烏（Polygoni multiflori Radix）源于蓼科植物何首烏（Polygonum multiflorum Thunb.）的干燥塊莖，其特有指標(biāo)性成分二苯乙烯苷（THSG），即2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（2，3，5，4-tetrahydroxyl-diphenylethylene-2-O-glu coside）（見(jiàn)圖1），具有抗肺腫瘤，抗動(dòng)脈粥樣硬化，降低膽固醇和血脂，提高免疫力等多種藥理活性[1-4]。但由于THSG具有水溶液中穩(wěn)定性差、體內(nèi)生物利用度低的特點(diǎn)，在一定程度上限制了其臨床上的應(yīng)用[5]。β-環(huán)糊精（β-CD）作為經(jīng)濟(jì)易得的藥用輔料，其安全性已被美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）認(rèn)證[6-7]。β-CD可以將藥物分子包入其空腔內(nèi)，減小外部物理化學(xué)環(huán)境對(duì)其穩(wěn)定性的影響，繼而對(duì)藥物起到保護(hù)性作用[8-9]。筆者利用β-CD對(duì)THSG進(jìn)行包合，發(fā)現(xiàn)β-CD改性后的THSG體外穩(wěn)定性有顯著提高，本研究對(duì)大鼠灌胃THSG及其β-CD包合物的藥代動(dòng)力學(xué)行為進(jìn)行研究，揭示β-CD包合作用對(duì)THSG體內(nèi)過(guò)程的影響，為THSG制劑開發(fā)以及臨床前應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 儀器 Waters 600E高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司）；AX205分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；XW-80A微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；N-EAVPTM111氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）；高速離心機(jī)（美國(guó)Tomos公司）；超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥品與試劑 THSG對(duì)照品（批號(hào)：110844－200606，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715－200212，中國(guó)藥品生物制品檢定所）；THSG提取物[自制，采用硅膠柱層析分離、重結(jié)晶純化制得，薄層色譜分析（TLC）顯示為單一斑點(diǎn)，二胺基聯(lián)苯胺（DAD）顯示為單一化合物峰，高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定其純度≥96%]；β－CD（孟州市華興生物化工有限責(zé)任公司）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；乙腈（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；超純水（美國(guó)Millipore超純水制備系統(tǒng)）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SD大鼠，級(jí)別SPF，雄性，體質(zhì)量200～220g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，許可證號(hào)：SCXK（津）2005－000。

1.4 包合物的制備 1g THSG提取物加入300 mL β-CD溶液（9 mol/L），10℃下避光攪拌6 h，4℃靜置過(guò)夜后減壓回收溶劑得包合物粉末，用少量乙醇洗滌后真空干燥，得到包合物粉末。經(jīng)熱重分析-差示量熱分析證實(shí)了THSG-β-CD包合物的形成，并用HPLC法測(cè)定該包合物中二苯乙烯苷含量為30.9%。

1.5 血漿樣品預(yù)處理 取大鼠血漿250 μL，精密加入50μL甲醇，50μL內(nèi)標(biāo)溶液（黃芩苷，1.4mg/L），渦旋10秒，加入0.2 mol/L的鹽酸溶液50 μL，渦旋1min，再加入甲醇750μL，渦旋3 min后14 000 r/min離心10 min。取上清液，氮?dú)獯蹈珊螅?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，14 000 r/min離心5 min，取上清液10 μL進(jìn)樣分析。

1.6 色譜條件 色譜柱：Warers SymmetryShieldTM RP－C18（150 mm×3.9 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－水－磷酸[25∶75∶0.05；V∶V∶V]；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：室溫。

1.7 藥代動(dòng)力學(xué)研究 20只大鼠隨機(jī)分成2組，每組10只，給藥前禁食12 h，自由攝水。按75 mg/kg（以THSG含量計(jì)算）的劑量，分別灌胃THSG-β-CD包合物溶液和THSG水溶液。其中每組5只均于給藥后 2、10、30、60、120、240 min，另 5 只于 5、20、40、90、180、360 min 從大鼠眼底靜脈叢取血，置肝素化試管中，離心（3 500 r/min）10 min，分離血漿，儲(chǔ)存于-20℃待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 特異性考察 分別取5只大鼠空白血漿各250 μL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，其余按“1.6”項(xiàng)下血漿樣品預(yù)處理操作和分析，得空白血漿色譜圖（見(jiàn)圖2A），將一定濃度待測(cè)物的對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿中，依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖（見(jiàn)圖2B），THSG和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為3.95 min和8.25 min，依同法獲得灌胃給予THSG后的血漿色譜圖（見(jiàn)圖2C）。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾THSG和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取空白血漿各250 μL，加THSG對(duì)照品系列溶液50 μL，配制成相當(dāng)于血漿濃度為0.025、0.050、0.10、0.20、0.80、1.60、3.20 mg/L 的 3 批血漿樣品，除不加50 μL甲醇外，按“1.5”項(xiàng)下樣品處理操作；以血漿中待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算,求得直線回歸方程為Y=7.703 4X-0.161，r=0.998 7。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，THSG的線性范圍為0.025～3.20 mg/L，定量下限為0.025 mg/L。

2.3 精密度與準(zhǔn)確度 分別取大鼠空白血漿250 μL，按“2.2”項(xiàng)下方法配制成濃度為 0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高濃度質(zhì)量控制（QC）樣品各6份，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3 d，即每個(gè)濃度有18個(gè)樣品。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算QC樣品的測(cè)得結(jié)果，進(jìn)行方差分析，計(jì)算本法的準(zhǔn)確度與精密度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 HPLC法測(cè)定大鼠血漿中THSG的精密度與準(zhǔn)確度

2.4 提取回收率 分別取濃度為0.05、0.20和0.80 mg/L的THSG低、中、高濃度血漿樣品各6份，按上述方法處理操作后進(jìn)樣分析；同時(shí)以相應(yīng)對(duì)照品溶液50 μL和內(nèi)標(biāo)溶液50 μL加入處理過(guò)的大鼠空白血漿樣品渦流混合后進(jìn)樣分析得峰面積，提取后的峰面積與之相比，比值計(jì)算提取回收率。大鼠血漿中3種濃度的THSG提取回收率分別為82.8%，83.5%和86.5%；內(nèi)標(biāo)提取回收率為62.3%。

2.5 穩(wěn)定性 取大鼠空白血漿250 μL，按“2.2”項(xiàng)下的方法配制成濃度為0.20 mg/L的血漿樣品，考察其在避光室溫放置4 h內(nèi)的穩(wěn)定性、血漿樣品1次和3次冷凍—解凍循環(huán)以及處理后樣品室溫放置24 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明血漿樣品在不同條件下RSD均小于3.0%，表明大鼠血漿樣品在室溫避光，冷凍保存放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究 SD大鼠灌胃THSG及包合物后,THSG的平均血藥濃度經(jīng)時(shí)曲線見(jiàn)圖3。血藥濃度數(shù)據(jù)用 DAS（Drug And Statistic 1.0）進(jìn)行擬合，計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。β-CD對(duì)THSG的改性作用對(duì)其藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程有明顯的影響，主要表現(xiàn)為：1）達(dá)峰時(shí)間提前，THSG經(jīng)β-CD包合后在體內(nèi)吸收速度加快。2）達(dá)峰濃度增高，大鼠灌胃THSG后的Cmax為 0.24 mg/L；THSG-β-CD組的Cmax為 1.16 mg/L。3）THSG-β-CD 組的藥物在體內(nèi)停留趨勢(shì)比THSG組增加，MRT分別為89.01 min和72.76 min。4）β－CD包合物給藥后6 h THSG的AUC值是單獨(dú)給予THSG的近3倍，表明β-CD包合可顯著提高THSG口服生物利用度。

3 討論

THSG經(jīng)β-CD改性后口服生物利用度明顯提高，吸收半衰期變短，消除半衰期延長(zhǎng)，藥物從體內(nèi)的表觀清除速率降低。推測(cè)可能由于THSG經(jīng)β-CD包合后其生物穩(wěn)定性增加，避免了藥物的分解和酶解。此外，β-CD可提高小腸細(xì)胞的膜通透性，增加藥物的吸收量，使藥物達(dá)峰時(shí)間提前且生物利用度提高。在胃腸環(huán)境中包合物與游離態(tài)THSG處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，隨著游離THSG的吸收，包合物中的THSG不斷向環(huán)境中釋放，從而使得胃腸道環(huán)境中的THSG維持一個(gè)較高的濃度，增加了藥物在腸道中的吸收時(shí)間，提高了THSG的吸收效果。β-CD還可被結(jié)腸部位的腸道菌群所降解而釋放出藥物，使其攜帶藥物在到達(dá)結(jié)腸后才被釋放吸收，增加藥物的吸收部位。

圖3 大鼠灌胃給予THSG和THSG-β-CD包合物血藥濃度-時(shí)間曲線

表2 THSG及其β-CD包合物主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=5）

表2 THSG及其β-CD包合物主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（±s，n=5）

注：與 THSG 比較，*P<0.05。

藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù) THSG THSG-β-CD Tmax（min） 9.00± 2.24 5.00± 0.00 Cmax（mg/L） 0.24± 0.09 1.16± 0.80*AUC0-360min[mg/（L·min）]11.50±3.9732.24±7.77*MRT（min） 72.76± 7.99 89.01± 22.99 VRT（min） 2 963.10±241.84 8 698.29±2 454.49*

THSG體內(nèi)降解產(chǎn)物分析：大鼠灌胃給予THSG后，血漿樣品的色譜圖中除THSG色譜峰外，還出現(xiàn)了2個(gè)新的色譜峰（tR分別為2.3 min和3.5 min，THSG為4.0 min）。此2個(gè)色譜峰的面積隨時(shí)間變化具有一定規(guī)律性，推測(cè)為THSG在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物色譜峰。其中tR=3.5 min的代謝物最為明顯，含量較高，推測(cè)是THSG在體內(nèi)最主要的代謝產(chǎn)物，通過(guò)后期膽汁排泄研究，證明其為THSG葡萄糖醛酸結(jié)合代謝產(chǎn)物。

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