張偉鋒，劉寶山

300193 天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院（劉寶山）

再生障礙性貧血（簡稱再障）是造血系統(tǒng)的常見疾病,其發(fā)生的確切機(jī)制至今尚未完全闡明，目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為再障的主要發(fā)病機(jī)制是免疫異常，而造血微環(huán)境與造血干/祖細(xì)胞量的改變是異常免疫損傷所致，其中T細(xì)胞亞群的異常在再障的發(fā)病過程中有著重要的作用[1]。

穿山龍是薯蕷科薯菠屬植物穿龍薯蕷（Dioscorea napponica.Mak）的根莖，具有活血舒筋、祛痰截瘧、消食利水之效[2]，穿龍薯蕷的主要化學(xué)成分為甾體皂苷類、是用于合成多種載體激素類藥物的重要原料之一，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用[3-5]。筆者應(yīng)用穿龍薯蕷皂苷治療再生障礙性貧血小鼠，觀察其對骨髓T細(xì)胞亞群的表達(dá)的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 近交系ICR小鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（20±2）g（以上動物均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射研究所，經(jīng)檢疫合格，合格號（SCXK<京>2009-0004）。

1.2 實驗用藥 薯蕷皂苷片（東盛科技股份有限公司西安制藥廠生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：200907035）。環(huán)孢素軟膠囊（華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：100501），雷公藤多苷片（浙江得恩德制藥有限公司，產(chǎn)品批號：1007119）。

1.3 實驗試劑 環(huán)磷酰氨（CY），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，10051421。氯霉素（CH），上海生工有限公司，CB0118-109。淋巴細(xì)胞分離液，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液，美國GBICO公司。優(yōu)質(zhì)胎牛血清，德國BIOCHROM AG公司。PE/Cy5 anti-mouse CD4，美國BD公司。PE anti-mouse CD8a，美國BD公司。FITC anti-mouse CD3，美國BD公司。

1.4 實驗儀器 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠。恒溫CO2培養(yǎng)箱，美國Fisher公司。25 mL培養(yǎng)瓶，美國Corning公司。離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠。倒置相差顯微鏡，日本Olnyrpus公司。流式細(xì)胞儀，美國Conlter制造廠。

1.5 方法

1.5.1 再障模型的建立 參照孫紀(jì)元等[1]報道方法，ICR 小鼠經(jīng) 60Coγ 射線（3Gy，劑量率 0.6，照射時間5min，距離4m）全身照射后，于第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰氨（CY）50 mg/kg，氯霉素(CH)62.5 mg/kg，每日1次；正常對照組行假照射（鉛磚屏蔽），于第4、5、6天腹腔注射等體積生理鹽水。第7天，隨機(jī)抽查造模小鼠外周血象、骨髓象，驗證成模。

1.5.2 分組與處理 選取健康ICR小鼠105只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選出15只設(shè)為正常對照組，其余隨機(jī)分為6組（模型組、西藥對照環(huán)孢素組、中藥對照雷公藤多苷組、中藥治療高劑量組、中藥治療中劑量組、中藥治療低劑量組），每組15只。分別為：1）正常對照組、模型組灌胃生理鹽水，每次0.2 mL，每日1次。2）西藥對照組：成模后予以環(huán)孢素軟膠囊23.5 mg/（kg·d），灌胃，每日1次。3）中藥對照組：成模后予以雷公藤多苷9.36mg/（kg·d），灌胃，每日1次。4）低劑量組：成模后予以薯蕷皂苷37.44 mg/（kg·d），灌胃，每日1次。5）中劑量組：成模后予以薯蕷皂苷74.88 mg/（kg·d），灌胃，每日1次。6）高劑量組：成模后予以薯蕷皂苷149.76mg/（kg·d），灌胃，每日1次。第7～14天，各組連續(xù)灌胃，第15天定為取材時間。

各組用藥參照成人劑量：環(huán)孢素軟膠囊150mg/d，雷公藤多苷片60 mg/d，薯蕷皂苷片低、中、高劑量分別為240，480，960 mg/d。參考陳奇《中藥藥理研究方法學(xué)》，按照“動物體表面積比率換算等效劑量法”計算小鼠給藥量。

1.5.3 小鼠骨髓單個核細(xì)胞（BMMNC）分離培養(yǎng)治療后第15天，斷頸處死小鼠，無菌條件下取雙側(cè)股骨，用帶有5號針頭的5 mL注射器吸取RPMI1640培養(yǎng)液，反復(fù)沖洗骨髓腔，將骨髓細(xì)胞收集在滅菌離心管內(nèi)，并反復(fù)吹打，使骨髓細(xì)胞充分分散，制成懸液。將充分混勻的細(xì)胞懸液以1∶1比例加在淋巴細(xì)胞分離液的表面上，離心2 000 r/min，10 min，分離出單個核細(xì)胞層，移入1個5 mL離心管內(nèi)。加入磷酸鹽緩沖液（PBS）2 mL，反復(fù)吹打，離心1 000 r/min，10 min，去上清液，洗兩次。用3mL1640培養(yǎng)液（青霉素0.073 7g/L、鏈霉素0.171 7g/L，碳酸氫鈉2g/L，10%胎牛血清）懸浮沉淀細(xì)胞，制成懸液計數(shù)，經(jīng)臺盼藍(lán)鑒定細(xì)胞活性在95%以上，將懸液移入25 mL培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%二氧化碳（CO2）飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后細(xì)胞消化后吸取移入離心管中，離心1000r/min，10min。收集培養(yǎng)上清液及BMMNC，流式細(xì)胞儀檢測。

1.5.4 骨髓CD3+、CD4+、CD8+檢測 將上述培養(yǎng)后的細(xì)胞吹打后移入離心管中，制成骨髓單個核細(xì)胞懸液，將細(xì)胞濃度調(diào)至 1×106細(xì)胞/mL。取懸液 100 μL，分別加入免疫熒光抗體FITC anti-mouseCD31 μL、PE/Cy5anti-mouseCD41μL、PEanti-mouseCD8a1μL。4℃，避光孵育 30min，PBS（7.2～7.4）緩沖液洗滌 2 次，離心，1 000 r/min，5 min，棄上清液，補(bǔ)足0.5 mL PBS，上流式細(xì)胞儀檢測、分析，設(shè)立陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血血象比較 見表1。

表1 治療后各組外周血細(xì)胞計數(shù)s）

表1 治療后各組外周血細(xì)胞計數(shù)s）

注：與正常組比*P＜0.05；與模型組比△P<0.05；與CsA組▲P<0.05；與雷公藤組比▲▲P<0.05。

組別 n 白細(xì)胞（×109） 血紅蛋白（g/L） 血小板（×109）正常組 15 13.50±3.36 172.50±41.62 800.30±36.94模型組 10 1.57±0.40 77.47±10.71 268.73±29.38低劑量組 11 5.76±0.70*△▲ 100.70± 5.67*△▲ 441.70±43.47*△▲中劑量組 12 11.97±2.02△▲▲ 139.08±11.70△▲▲ 730.08±99.6△▲▲高劑量組 11 8.72±2.15*△▲▲114.60± 4.95*△▲▲651.50±45.24*△▲▲Cs A 組 11 8.86±1.49 115.91± 5.20 529.45±30.42雷公藤組 10 5.69±1.21 98.64± 7.09 412.18±39.98

治療后各治療組與模型組、正常對照組比較差異均有顯著性。穿龍薯蕷皂苷低、中、高3組組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），以中劑量組最優(yōu)。其與兩者陽性藥物對照組比較均具有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 再障小鼠骨髓象比較 正常對照組骨髓增生活躍，骨髓小粒造血細(xì)胞豐富。模型組骨髓粒系、紅系、巨核系三系增生減低，骨髓非造血細(xì)胞較多。治療后各組骨髓增生比較活躍，骨髓小粒造血細(xì)胞不同程度恢復(fù)，穿龍薯蕷皂苷中劑量組優(yōu)于低、高劑量組及各陽性對照組。

2.3 各組小鼠骨髓CD3+、CD4+、CD8+檢測 見表2。

表2 小鼠骨髓 CD3+、CD4+、CD8+表達(dá)（±s）%

表2 小鼠骨髓 CD3+、CD4+、CD8+表達(dá)（±s）%

注：與正常組比較*P<0.05，與模型組比較△P<0.05，與CsA組比較▲P<0.05，與雷公藤組比較▲▲P<0.05。

組別 CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+正常組 74.6±2.29 49.54±1.66 25.87±1.91 1.71±0.17模型組 60.42±1.40* 39.26±1.89* 39.76±1.61* 1.06±0.25*低劑量組 65.57±2.13*△ 43.94±1.30*△ 38.26±1.14* 1.13±0.11*中劑量組 73.18±1.50△▲▲ 49.82±1.70△▲▲26.02±1.83△▲▲1.80±0.27△▲▲高劑量組 72.99±1.87△▲▲ 47.98±1.38△▲▲37.17±2.31* 1.26±0.21*CsA 組 68.23±1.32*△ 44.67±1.68*△ 36.93±1.46* 1.16±0.24*雷公藤組 62.84±0.92*△ 43.55±1.50*△ 37.81±2.03* 1.15±0.13*

CD3+和CD4+表達(dá)模型組低于正常組（P<0.05），CD8+表達(dá)模型組高于正常組（P<0.05），治療各組與模型組相比均有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中中、高劑量組與正常組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中、高劑量組與兩陽性對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

CD4+/CD8+比值：模型組低于正常組（P<0.05），中劑量組與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），治療組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3 討論

根據(jù)再障的發(fā)病特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)可將其歸屬于“虛勞”、“血虛”、“血證”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨，生髓”、“血者水谷之精也，生化于脾”，認(rèn)為病機(jī)以脾腎為本，尤與腎關(guān)系密切，病機(jī)關(guān)鍵在于“腎虛”，補(bǔ)腎治療是中醫(yī)藥治療再障的重要法則，但又因其病程遷延，日久難愈，固有“久病必瘀”之說，研究表明中藥穿龍薯蕷有化痰活血之功效，并有免疫調(diào)節(jié)作用。故筆者應(yīng)用穿龍薯蕷皂苷治療再障小鼠，以觀察其療效，探討其免疫作用機(jī)制。

T淋巴細(xì)胞亞群是機(jī)體免疫系統(tǒng)中主要的調(diào)節(jié)因子及效應(yīng)細(xì)胞，它可通過對抗原識別、處理、遞呈等引起多種細(xì)胞因子同多種細(xì)胞之間的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系，從而構(gòu)成維持機(jī)體免疫功能的生理狀態(tài)。參與免疫應(yīng)答的主要T細(xì)胞為CD3+、CD4+和CD8+細(xì)胞。

本實驗研究結(jié)果顯示再障模型組小鼠骨髓CD3+、CD4+的表達(dá)明顯低于正常對照組（P<0.05），CD8+的表達(dá)高于正常對照組，CD4+/CD8+比值顯著低于正常對照組。給予穿龍薯蕷皂苷治療后，低、中、高劑量組CD3+、CD4+的表達(dá)以及CD4+/CD8+比值明顯高于模型組（P<0.05），且中、高劑量組與陽性對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。說明穿龍薯蕷皂苷能調(diào)節(jié)提高再障小鼠骨髓CD3+、CD4+的表達(dá)，抑制小鼠骨髓CD8+的表達(dá)，促進(jìn)CD4+/CD8+比值的恢復(fù)，從而抑制骨髓T細(xì)胞的異常激活，促進(jìn)骨髓造血功能的恢復(fù)。

[1]徐淑芬，白 海，王存邦，等.再生障礙性貧血患者骨髓T細(xì)胞亞群與免疫抑制治療療效的關(guān)系[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2010,31（6）：401-403.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977:1726.

[3]于海榮，工濟(jì)興，陳建雙，等.穿山龍總皂昔含藥血清對小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及IL-6產(chǎn)生影響的實驗研究[J].江蘇中醫(yī)藥，2007，39（1）：57-58.

[4]王濟(jì)興，張風(fēng)英，宋鴻儒，等.穿山龍總皂苷對大鼠T淋巴細(xì)胞功能影響的血清藥理學(xué)研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(9):1653-1654.

[5]舒 艷.穿龍薯蕷抗癌活性成分的研究[D].沈陽：沈陽藥科大學(xué)，2006：251.

[6]孫紀(jì)元,王四旺,施新猷,等.再生障礙性貧血的動物模型實驗研究[J].中國實驗動物學(xué)雜志,2000,10(4):210-211.