第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院病理科(西安 710038)

蘭 淼 李艷紅△ 朱少君 鞏 麗 韓秀娟 任 拼 姚 麗 張 偉#

宮頸癌一直是影響婦女健康的主要疾病。近年來研究發(fā)現(xiàn),大約有 90%的人類宮頸癌細胞中可檢測到HPVDNA,由于宮頸癌存在著一個較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期,早期宮頸癌患者 5年治愈率高達 90%,所以早期發(fā)現(xiàn)一過性 HPV攜帶者對早期診斷、治療尤為重要[1]。L TS技術(shù)對傳統(tǒng)的巴式涂片進行了改良,制備的薄層涂片細胞信息量大,而且清晰便于閱讀。本文對同一病人的標本采用 HPV16/18和 LTS聯(lián)合檢測,以探討其在宮頸癌前病變中的診斷意義,現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 病例選擇 選擇 2010年 4月至 2011年 3月在我院婦科門診及生殖中心就診、自愿行 LTS檢查HPV16/18檢測的 1 000例患者作為觀察對象。入選患者從未進行 LTS、陰道鏡等相關(guān)檢查及治療,均有性生活史,且無子宮切除史,無宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變史。年齡最小 16歲,最大 77歲,平均年齡 36.23歲。 對其中細胞學(xué)篩查陽性和臨床高度懷疑宮頸病變的患者行陰道鏡檢查和鏡下活組織病理檢查。

2 材料選擇 LTS液基細胞學(xué)檢測試劑盒為珠海市麗拓發(fā)展有限公司生產(chǎn),試劑盒組成均包括細胞收集瓶、標本采集刷、細胞處理基液、清潔液、離心管、載玻片。兔抗人 HPV16/18 E6抗體和羊抗兔 IgGHRP均購于美國 Santa公司。

3 標本采集 用無菌棉簽擦去受試患者宮頸表面粘液,將 LTS標本采集刷插入頸管約 1cm,保持適當(dāng)壓力,順時針旋轉(zhuǎn) 5～8圈,取出細胞刷將刷頭放入盛有 5ml LTS液基細胞保存液中。

4 LPT液基細胞學(xué)技術(shù) 保存液中的標本經(jīng)渦式混勻器振蕩混勻 5min,倒入加有 4 ml清潔液的離心管內(nèi),標記患者信息于管壁上,離心 10min,速度為 2 500r/min,將上清液倒回細胞保存液瓶內(nèi),加 2ml細胞處理基液振蕩搖勻后吸 50ul滴在玻片上制成直徑15mm的薄層涂片,自然干燥后 95%乙醇固定、巴氏染色、封片。將細胞保存液瓶內(nèi)殘液保存在 2ml的 EP管中做好標記,置于 4℃冰箱,用于提取 DN A。

5 免疫印記法檢測宮頸液基細胞殘液中HPV16/18的表達 將盛有樣本的 2 ml EP管置于碎冰中,用超聲波細胞粉碎機將其中的細胞打碎,10 000轉(zhuǎn) 4℃離心 30min,取上清,編號,進行蛋白定量,保存在 4℃冰箱內(nèi)備用。采用十二烷基硫酸鈉-變性聚丙烯酰胺凝膠不連續(xù)緩沖系統(tǒng),先后配 15%的分離膠和5%的濃縮膠;取蛋白樣品,上樣 2 0ul(約含蛋白32ug),電泳積層膠 80V、30min,分離膠 120V、70min;在轉(zhuǎn)移緩沖液中進行電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上;將該膜在麗春紅染液中染色 5min,觀察電泳及轉(zhuǎn)移效果;轉(zhuǎn)移后放入 TBS中洗膜 10min,封入含有 5%BSA封閉液的塑料袋中 37℃緩慢搖動 1.5h;以含有 0.5%Tween-20的 TBS洗膜;將膜封入塑料袋中;加入一抗(1∶400)4℃過夜,洗膜,加二抗(1∶ 2000)孵育 2h;DAB顯色 8 mi n。該膜上有顯色帶出現(xiàn)為陽性;若無顯色帶出現(xiàn)為陰性。

6 診斷標準 LT S診斷標準采用 2001年國際癌癥協(xié)會 TBS診斷系統(tǒng)[1]。 LTS結(jié)果按 2001年國際癌癥協(xié)會 TBS系統(tǒng)分類:正常范圍;意義不明的不典型鱗狀細胞和腺細胞 (ASCUS,AGUS);高度鱗狀上皮病變、不典型鱗狀細胞(ASCUS-H);低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL);高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL);鱗狀上皮癌和腺癌。

7 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)采用 SPSS10.10軟件進行 χ2檢驗。

結(jié) 果

1 L TS檢測結(jié)果分析 LTS結(jié)果發(fā)現(xiàn)正?；蜓装Y患者 870例,ASCUS 24例,ASCUS-H 26例,LSIL 61例,HSIL 19例。

2 細胞學(xué)異?；颊卟±碓\斷結(jié)果 LTS異常的130例患者行陰道鏡下多點組織活檢,病理診斷正?；蜓仔苑磻?yīng) 71例,輕度不典型增生 CINI 18例,中度不典型增生 CINII 21例,重度不典型增生 CINIII 13例,浸潤癌 2例,濕疣 5例。

3 HPV16/18感染與病理診斷的關(guān)系 見附表。130例 LTS結(jié)果異常患者中,進行 HPV16/18檢測,結(jié)果顯示,隨病理級別的升高,HPV16/18感染率顯著上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。

附表 HPV16/18感染與病理診斷的關(guān)系 [(例)%]

4 細胞學(xué)、病理學(xué)和 HPV16/18檢測的比較對 LT S正?；蜓装Y而 HPV16/18陽性,同時高度懷疑宮頸病變患者 65例進行陰道鏡下多點組織活檢,結(jié)果顯示,正?；蜓仔苑磻?yīng) 51例,CINI 9例,CINII 5例,未發(fā)現(xiàn) CINIII及以上的病例。 LTS正?；蜓装Y和 HPV16/18陽性患者中,宮頸病變的檢出率為 21.5%,提示聯(lián)合液基細胞學(xué)和 HPV16/18檢測可提高宮頸早期癌變的檢出率。

討 論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤,近年來宮頸癌的發(fā)病率呈年輕化的上升趨勢。流行病學(xué)和生物學(xué)資料已證明人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)病變的主要病因[2],尤其是高危型 HPV16/18。但HPV感染多為一過性,常在 8～10月左右消失,只有一小部分發(fā)展為持續(xù)感染,持續(xù)攜帶 HPV才有可能引起宮頸上皮內(nèi)病變和宮頸癌。因此檢測 HPV對于宮頸病變的早期診斷,早期治療意義重大。

液基細胞學(xué)檢查是宮頸癌及癌前病變篩查的主要檢查方法之一[3]。然而,液基細胞學(xué)是通過挖空細胞來診斷 HPV感染的,挖空細胞核周有空暈及易出現(xiàn)雙核現(xiàn)象和異型性的原因影響觀察,因此具有一定的局限性。免疫印跡法作為檢測 HPV感染的常用方法,具有抗原性保存好、檢測結(jié)果精確的優(yōu)點。本研究利用 LTS液基細胞學(xué)檢查后剩余的宮頸液基細胞殘液進行免疫印記法 HPV檢測。結(jié)果表明,LTS正常或炎癥和HPV16/18陽性患者中,宮頸病變的檢出率為 21.5%,提示聯(lián)合 LTS液基細胞學(xué)和 HPV16/18檢測可提高宮頸早期癌變的檢出率。 LT S結(jié)果異?；颊咧?宮頸癌、CINⅢ、CINⅡ、CINⅠ的 HPV16/18陽性率分別為 100%、69.2%、33.3%、16.7%。體現(xiàn)了 HPV16/18的檢出率隨著宮頸病變的嚴重程度增加而增加。HPV16/18對篩查 CINⅡ、Ⅲ和早期宮頸癌的敏感度很高,能夠把可高風(fēng)險人群篩查出來。顯示了 HPV16/18適合作為篩查宮頸高度病變的一種簡便方法,可以篩查出高風(fēng)險人群,并使帶有病毒而目前細胞學(xué)正常的女性得以隨訪,從而降低宮頸癌的發(fā)生。若將 LTS液基細胞學(xué)檢查與殘液 HPV16/18檢測聯(lián)合起來可以彌補相互的不足,是一種高效而經(jīng)濟適用的宮頸癌前病變篩查方案,值得大力推廣。

本文采用 LTS技術(shù)對液基細胞殘液 HPV檢測,在國內(nèi)尚屬首次。LTS液基細胞學(xué)檢查是一種國產(chǎn)新型液基細胞檢查技術(shù),其制片質(zhì)量好、經(jīng)濟適用、操作方便[4]。利用 L TS液基細胞殘液進行免疫印記法HPV16/18檢測結(jié)果準確、方便易行并能減低篩查的費用,是一種高效又經(jīng)濟的篩查方法。陰道鏡下對可疑病灶進行活檢是最后明確診斷的手段。因此對于HPV16/18和(或)LTS檢查結(jié)果異常者,應(yīng)進行陰道鏡檢查與宮頸活檢,是最穩(wěn)妥的宮頸癌篩查方案之一,可以把漏診率降到最低[5]。但這一方案篩查的成本增加,也不是所有婦女都同意接受陰道鏡檢查,不適合作為常規(guī)篩查手段。

[1]陳麗宏,劉曉琴,楊春榮,等.液基細胞學(xué)聯(lián)合高危型 HPV檢測在宮頸疾病診斷中的應(yīng)用[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2007,36(10):1377-1379.

[2]Petry KU,Menton S,Menton M,et al.Inclusion of HPV test ingin routi necervical cancer screeningfor woman above 29 years in Gemany:results for 8466 patients[J].Br J Cancer,2003,88(10):1570-1577.

[3]初 霞,張喜卿,王巧云.液基薄層細胞學(xué)和 HPV原位雜交在宮頸疾病診斷中的應(yīng)用[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2009,26(5):15-16.

[4]蘭 淼,鞏 麗,李艷紅,等.兩種液基細胞試劑盒對篩查早期宮頸癌應(yīng)用價值的對比研究 [J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2010,18(12):2466-2468.

[5]岑堅敏,錢德英,黃志宏,等.陰道鏡對宮頸上皮內(nèi)瘤變的診斷價值 [J].中國實用婦科與產(chǎn)科雜志,2003,19:215-218.