陜西省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心(西安 710003)姚養(yǎng)正 姜姍姍 楊章民 齊 浩

乳腺腫瘤可發(fā)生于人類和大鼠的乳腺部位,腫瘤組織病理學(xué)形態(tài)各異,在腫瘤的同一體內(nèi)也存在著明顯不同的細胞亞群,表現(xiàn)在不同的細胞形態(tài)、核型、遺傳標志物、生長率、細胞產(chǎn)物、受體、酶、免疫特性和對抗腫瘤藥物的敏感性差異。腫瘤的生物學(xué)特性主要體現(xiàn)在增殖與分化的控制失調(diào)、浸潤與轉(zhuǎn)移性,但這不是所有腫瘤細胞的共同特性,只是在腫瘤組織中一部分細胞亞群具有浸潤特性,并有不同的轉(zhuǎn)移能力[1～5]。本文以我們自己建立的一株 CHN大鼠自發(fā)性乳腺癌為材料,對其在動物體內(nèi)的生長與轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性進行了研究,為揭示該瘤株在動物體內(nèi)生長、浸潤與轉(zhuǎn)移規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

1 實驗材料

1.1.動物:CHN、 SHR、WKY、 LOU/M近交系大鼠和 CHN×LOU/M F1代大鼠,由陜西省中醫(yī)藥研究院實驗動物中心提供(合格證號為:醫(yī)動字第 08-25號)。

1.2 瘤株:大鼠自發(fā)性乳腺癌瘤株,為本中心建立并保存。

2 實驗方法

2.1 瘤細胞懸液的制備:取生長 20d的荷瘤大鼠用拉脫頸椎法處死,常規(guī)消毒,在無菌操作下取出腫瘤組織,剪去瘤周組織及壞死部分,用生理鹽水沖冼,選擇生長良好的新鮮組織,稱取 2g置培養(yǎng)皿內(nèi),剪碎放入特制的 60目細胞篩里,按瘤重:生理鹽水=1∶2(g/ml)的比例加入滅菌生理鹽水,用研磨棒研磨或用組織研磨器研磨,根據(jù)實驗需要調(diào)節(jié)細胞濃度。

2.2 瘤細胞數(shù)對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的影響:CHN大鼠 40只,雌性,體重 160± 10g隨機分成四組,每組 10只。用同一瘤源制成的瘤細胞懸液,逐級稀釋成不同濃度,每一濃度接種一組,每只大鼠右腋皮下接種瘤細胞懸液 0.2ml,注射的瘤細胞數(shù)分別為 2×109、2× 107、2× 105和 2× 103個。

2.3 不同接種途徑對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的影響:CHN大鼠 40只,雌性,體重 160± 10克,隨機分成四組,每組 10只。用同一瘤源制成的瘤細胞懸液,分別在每組大鼠右腋皮下、腹腔、后肢肌肉和尾靜脈各接種瘤細胞懸液 0.2ml,注射的瘤細胞數(shù)均為 2×106個。

2.4 大鼠性別對自發(fā)性乳腺癌生長的影響:CHN大鼠 20只,雌雄各半,體重 160± 10g,按性別分成二組,每組 10只。用同一瘤源制成的瘤細胞懸液,分別接種于每組大鼠右腋皮下 0.2ml,注射的瘤細胞數(shù)均為 2× 106個。

2.5 不同品系大鼠對自發(fā)性乳腺癌生長的影響:CHN、SHR、WKY、LOU/M 和 CHN×LOU/M F1大鼠共 50只,按大鼠品系分成五組,每組 10只。各組大鼠均為雌性,體重分別為 CHN大鼠 160±10g,SHR大鼠 130±10g、WKY大鼠 130± 10g、 LOU/M大鼠 130±10g,CHN× LOU/M F1 160±10g。用同一瘤源制成的瘤細胞懸液分別接種于每組大鼠右腋皮下 0.2ml,注射的瘤細胞數(shù)均為 2×106個。

2.6 大鼠自發(fā)性乳腺癌浸潤與轉(zhuǎn)移的觀察:分別對不同接種途徑形成的腫瘤進行觀察,待荷瘤大鼠接近死亡前,取腫瘤、浸潤與轉(zhuǎn)移腫瘤,用 10%福爾馬林溶液固定,石蠟包埋切片,HE染色,在光鏡下做病理學(xué)觀察。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用 SPSS13.0軟件處理。

結(jié) 果

1 不同瘤細胞數(shù)對腫瘤生長的比較 動物成瘤觀察結(jié)果見表 1,可以看出,各組大鼠移植不同數(shù)量的瘤細胞懸液后,腫瘤發(fā)生率均為 100%,其腫瘤潛伏期和宿主存活時間隨接種瘤細胞數(shù)的減少而延長,趨勢明顯。如果從宿主存活時間中減去潛伏期的天數(shù),自瘤結(jié)可觸知至死亡,比較各組大鼠存活天數(shù)、腫瘤重量和瘤系數(shù)均無顯著性差異(P＞0.05)。

表1 瘤細胞數(shù)對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的影響(±s)

表1 瘤細胞數(shù)對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的影響(±s)

注:組間兩兩相比*P＞ 0.05,△P＞ 0.05,#P＞ 0.05

瘤細胞數(shù)(個)接種鼠數(shù)(只)長瘤鼠數(shù)(只)成瘤率(%)潛伏天數(shù) 荷瘤宿主存活天數(shù)宿主瘤重(g)瘤系數(shù)2× 109 10 10 100 3.3± 0.46 55.3± 8.22* 42.5± 430△ 0.32± 0.02#2× 107 10 10 100 5.4± 0.52 58.7± 8.88* 40.7± 5.79△ 0.29± 0.02#2× 105 10 10 100 7.3± 0.48 60.9± 7.75* 40.3± 2.98△ 0.30± 0.01#2× 103 10 10 100 9.9± 0.88 67.2± 7.24* 40.8± 42△ 90.28± 0.02#

2 不同接種途徑對腫瘤生長的比較 成瘤觀察結(jié)果見表 2,分析發(fā)現(xiàn)各組大鼠接種瘤細胞后,腫瘤發(fā)生率均為 100%。皮下與肌肉內(nèi)接種瘤細胞,局部均可長出較大的瘤塊;腹腔內(nèi)接種瘤細胞懸液后,可見在腹腔內(nèi)形成大小不等的實體性腫瘤結(jié)節(jié),但是未見腹水形成;靜脈接種瘤細胞懸液后,在胸腔、肝與胸膜內(nèi)形成多個實體性瘤結(jié)節(jié)。雖然不同接種途徑的成瘤率均為 100%,但帶瘤宿主的平均存活時間有非常顯著的差異(P＜0.001),其中腹腔接種后存活時間最短,肌肉接種最長。

表2 接種途徑對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長與存活時間的比較

3 大鼠性別對腫瘤生長的比較 動物觀察結(jié)果見表 3,腫瘤在不同性別大鼠中移植成活率均為100%,比較荷瘤大鼠宿主存活時間、瘤重和瘤系數(shù)在雌雄大鼠之間均無顯著性差異(P＞0.05),提示大鼠自發(fā)性乳腺癌屬于非激素依賴性瘤株。

4 大鼠不同品系對腫瘤生長的觀察 動物觀察結(jié)果見表 4,可以看出大鼠自發(fā)性乳腺癌僅在 CHN系大鼠和 CHN× LOU/M F1代大鼠體內(nèi)呈進行性生長,腫瘤發(fā)生率為 100%,而且動物體重與瘤重成正比。統(tǒng)計結(jié)果表明,CHN大鼠與 SHN×LOU/M F1代大鼠體重與瘤重差異性非常顯著(P＜0.01);但是比較 CHN大鼠與 SHN×LOU/M F1代荷瘤大鼠的存活天數(shù)與瘤系數(shù)卻無顯著性差異(P＞0.05);腫瘤在SHN、WKY和 LOU/M品系大鼠體內(nèi)則不能生長,顯示大鼠自發(fā)性乳腺癌是 CHN近交系大鼠的一種同基因型(Syngeneic)瘤株。

表3 大鼠性別對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的影響(±s)

表3 大鼠性別對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的影響(±s)

注:雌雄相比*P＞0.05

性別 瘤細胞數(shù)(個)接種鼠數(shù)(只)長瘤鼠數(shù)(只)成瘤率(%)荷瘤宿主存活天數(shù) 宿主瘤重(g)瘤系數(shù)雌 2× 106 10 10 100 42.8± 6.27 42.1± 4.18 0.31± 0.04*雄 2× 106 10 10 100 43.2± 5.99 41.1± 3.35 0.03± 0.03*

表4 大鼠自發(fā)性乳腺癌在不同大鼠品系中的生長情況(±s)

表4 大鼠自發(fā)性乳腺癌在不同大鼠品系中的生長情況(±s)

注:CHN與 SHN× LOU/M F1相比*P ＜0.01,**P＞ 0.05

大鼠品系 瘤細胞數(shù)(個)接種鼠數(shù)(只)長瘤鼠數(shù)(只)荷瘤宿主存活天數(shù)(x-±SD)宿主瘤重(g)瘤系數(shù)CHN 2× 106 10 10 47.7± 10.8 44.2± 6.72* 0.28± 0.05**SHR 2×106 10 0 0 0 0 YKY 2×106 10 0 0 0 0 LOU/M 2×106 10 0 0 0 0 CHN× LOU/M F1 2× 106 10 10 45.0± 8.83 38.4± 4.03* 0.35± 0.02**

5 腫瘤浸潤與轉(zhuǎn)移的病理學(xué)觀察 大鼠腋部皮下接種瘤細胞懸液后,見皮下腫瘤生長、瘤細胞排列成條索狀,可見殘留毛囊。引起匯流淋巴結(jié)和肺部的轉(zhuǎn)移灶,前者癌細胞排列成腺管狀和條索狀,后者破壞原有肺組織,侵至支氣管周圍,癌細胞呈立方狀并且排列成小梁狀。

大鼠肌肉接種瘤細胞后,形成的局部腫瘤,癌細胞呈立方狀或扁平狀,形成大小不等的腺腔樣結(jié)構(gòu);在心、肺、肝、脾和直腸均可見到轉(zhuǎn)移灶。在心腔內(nèi)形成實體性腫瘤,心壁肌肉遭受破壞,癌細胞為多邊形,大小不等,排列成巢狀。肺部可見大小不等的轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)突起,破壞原有肺組織,癌細胞呈多邊形、異形性明顯,排列成片狀。肝轉(zhuǎn)移灶癌細胞呈多邊形或扁平形,前者排列成小粱狀,后者則圍成大小不等的腺腔。脾轉(zhuǎn)移灶癌細胞呈多邊形,形成巢狀,融合成片,而胃肌層轉(zhuǎn)移癌細胞排列成條索狀,形成少數(shù)腺腔,直腸肌層轉(zhuǎn)移癌細胞則為多角形,并形成不規(guī)則的腺管樣結(jié)構(gòu)。

大鼠腹腔接種瘤細胞懸液后,在腹腔內(nèi)形成大小不等的實體性瘤結(jié)節(jié),癌細胞呈多邊形,有的則為扁平狀,排列成不規(guī)則的腺管,間質(zhì)豐富。腫瘤侵犯肝、脾、胃及腸道,受侵犯的肝、脾組織與癌組織分界不清,癌細胞排列成巢狀及條索狀,同時見腫瘤侵至胃、小腸、結(jié)腸和直腸外膜及肌層,癌細胞多數(shù)排列成巢狀或小粱狀,腎包膜則可見癌細胞排列成小巢狀或條索狀。

大鼠靜脈接種瘤細胞后,在胸腔內(nèi)形成多個實體性瘤結(jié)節(jié),癌細胞顯示典型的上皮特征,為多邊形,有的胞漿透亮,排列成巢,可見腺樣結(jié)構(gòu)。在心、肺、肝和腎臟可見轉(zhuǎn)移灶。心腔內(nèi)形成實體性腫瘤緊附于心室壁,附著部心內(nèi)膜被破壞,瘤體附著部可見小梁狀血栓形成,癌細胞大小不等,呈多邊形,排列成片狀;肺組織表面可見多發(fā)性腫瘤結(jié)節(jié)隆起,破壞原有肺組織,癌細胞成片狀,殘留肺組織呈代償性肺氣腫;正常肺組織被癌組織代替,兩者分界不清,癌細胞為多邊形,排列成不規(guī)則條索狀;腎皮質(zhì)形成的腫瘤,破壞原有的腎組織,兩者分界不清,癌細胞為多邊形或立方狀,排列成條索狀,可見腺管形成。

討 論

不同瘤細胞數(shù)對大鼠自發(fā)性乳腺癌生長的比較,其潛伏期和宿主存活時間成明顯負相關(guān),與以往有關(guān)小鼠乳腺癌瘤株的報告相吻合[6]。在本實驗中,接種瘤細胞數(shù)最大為 2×109個,此時腫瘤潛伏天數(shù)為 3.3±0.46d,宿主存活時間為 55.3±8.22d,但當瘤細胞數(shù)減少到 2×103個時,潛伏天數(shù)見增加 2倍,宿主存活天數(shù)延長了 22%,仍表現(xiàn)出大鼠自發(fā)性乳腺癌細胞對CHN大鼠的高度適應(yīng)性。盡管接種不同瘤細胞數(shù)量的潛伏天數(shù)和宿主存活天數(shù)的差異有非常顯著性(P＜0.001);但是其瘤體重量和瘤系數(shù)之間均無顯著性差異(P＞0.05)。因而可以認為在本實驗條件下,大鼠自發(fā)性乳腺癌細胞接種 CHN大鼠后,導(dǎo)致動物死亡的移植瘤體積是一個相對穩(wěn)定的值,腫瘤重量約為 40.3±2.98g。

不同途徑(皮下、肌肉、腹腔和靜脈)接種大鼠自發(fā)性乳腺癌細胞后,腫瘤發(fā)生率均為 100%,提示本瘤株無論以何種途徑接種于 CHN大鼠體內(nèi),均可造成CHN大鼠移植性腫瘤,但是不同接種途徑的宿主存活天數(shù)明顯不同,以腹腔接種者大鼠存活天數(shù)最短(29.3±2.45d),以肌肉接種者存活天數(shù)最長(62.4±3.2d)。這種情況符合人類惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的規(guī)律,實際上由于腹腔的條件適合腫瘤生長,而且具有相當?shù)哪[瘤種植面積,因此惡性腫瘤腹腔播散者臨床預(yù)后差,存活時間短[7]。

不同性別大鼠接種大鼠自發(fā)性乳腺癌移植成活率為 100%,帶瘤大鼠宿主存活時間、腫瘤重量和瘤系數(shù)在雌雄大鼠之間均無顯著差異(P＞0.05),同小鼠乳腺癌 MC-615瘤株相似。提示大鼠自發(fā)性乳腺癌是非激素依賴性瘤株。

大鼠不同品系接種瘤細胞懸液后,腫瘤僅在 CHN系大鼠與 CHN× LOU/M F1代大鼠體內(nèi)生長,而在CHR、WKY和 LOU/M系大鼠體內(nèi)不生長,證明大鼠自發(fā)性乳腺癌是 CHN大鼠的一種同基因型瘤株,同小鼠 MC-615瘤株相似。

此外,不同接種途徑均程度不同地發(fā)生臟器轉(zhuǎn)移,其中以肌肉和靜脈內(nèi)接種最為嚴重,轉(zhuǎn)移灶累及心、肝、脾、肺、腎和消化道。腹腔內(nèi)接種主要引起腹腔內(nèi)有關(guān)臟器外源性轉(zhuǎn)移浸潤;而腋部皮下接種腫瘤形成局部移植瘤外僅造成匯流淋巴結(jié)與肺臟的移癌;肌肉部位血管豐富,移植腫瘤后易發(fā)生全身性血道轉(zhuǎn)移;靜脈接種更是如此。事實上各器官組織轉(zhuǎn)移性腫瘤的發(fā)生率也不同,形態(tài)表現(xiàn)各異,好發(fā)情形不同,各自具有不同的臨床意義。根據(jù)臨床統(tǒng)計,肝和肺是血道轉(zhuǎn)移最易侵犯的器官,分別占臟器轉(zhuǎn)移的 40%～50%和 30%～40%。肝臟血液供應(yīng)十分豐富,肝組織很可能為瘤細胞提供合適的生長環(huán)境,肺臟是機體進行氣體交換的場所,肺組織也可能為腫瘤細胞生長提供所需的氧氣與二氧化碳。大鼠自發(fā)性乳腺癌在 CHN大鼠中接種易發(fā)生肝、肺轉(zhuǎn)移,提示肝、肺臟器官同人類一樣為瘤細胞生長提供合適的條件。人腎臟轉(zhuǎn)移癌占 7.6%,而且以乳腺腫瘤來源的轉(zhuǎn)移癌最為多見,轉(zhuǎn)移灶絕大多數(shù)位于腎皮質(zhì)部,尤其在腎包膜下,本文所見大鼠自發(fā)性乳腺癌腎轉(zhuǎn)移也具有這個特點。

人類乳腺癌可通過淋巴或血行轉(zhuǎn)移,也可直接擴散到鄰近的組織。經(jīng)淋巴擴散最常見的是轉(zhuǎn)移到同側(cè)腋窩淋巴結(jié),也可擴散到乳淋巴結(jié)或其他區(qū)域淋巴結(jié)。盡管乳腺癌可轉(zhuǎn)移至任何部位,但最常見的部位是骨、肺及肝臟[1]。大鼠自發(fā)性乳腺癌的轉(zhuǎn)移也具有淋巴道和血道轉(zhuǎn)移的特點,而且在心臟觀察到轉(zhuǎn)移癌屬罕見,脾臟及消化道轉(zhuǎn)移也屬少見,這可能與臟器的功能結(jié)構(gòu)有關(guān)。但是大鼠自發(fā)性乳腺癌在 CHN大鼠體內(nèi)造成的轉(zhuǎn)移癌累及部位之多,這與瘤株本身的惡性程度有關(guān),也與宿主 CHN大鼠的易感染性有關(guān)。因此,我們可以認為 CHN大鼠自發(fā)性乳腺癌瘤株是一個獨特的,容易復(fù)制的乳腺癌動物模型,這將為研究乳腺癌轉(zhuǎn)移機制及治療提供一種新的瘤株。

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