閻光甫 張利莉

微生物物種豐富、分布廣泛，是一類具有巨大開發(fā)潛力的生物資源和基因資源。因其長(zhǎng)期以來有著重要的研究?jī)r(jià)值，世界各國(guó)對(duì)微生物資源的研究和開發(fā)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈。隨著對(duì)微生物資源研究不斷深入和規(guī)模的相繼擴(kuò)大，出現(xiàn)了一系列與微生物相關(guān)的數(shù)據(jù)分析工具及網(wǎng)站［1］，而安裝和維護(hù)這些生物信息軟件不但耗時(shí)，而且不宜普及和維護(hù)。微生物信息資源平臺(tái)的建立，旨在給微生物研究人員提供一個(gè)“一站式”的在線生物科研平臺(tái)，提高科研工作效率，加快微生物資源的相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 平臺(tái)運(yùn)行環(huán)境

本平臺(tái)屬于小型的科研網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，初步建立在PC上，通過分配靜態(tài)IP接入校園網(wǎng)。采用Ubuntu Server 10.04的Linux作為服務(wù)器操作系統(tǒng)，Web服務(wù)由Apache 2.2.14提供，通過集成功能模塊實(shí)現(xiàn)具體分析功能。選擇B/S(Brower/Server，瀏覽器/服務(wù)器)結(jié)構(gòu)作為其工作運(yùn)行模式的結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)過程如圖1所示。

圖1 B/S結(jié)構(gòu)的實(shí)現(xiàn)過程

本平臺(tái)所需的所有軟件均為免費(fèi)開源軟件，可以從互聯(lián)網(wǎng)免費(fèi)下載，在開源協(xié)議下可免費(fèi)、自由使用。相關(guān)軟件的功能及下載地址見表1。

表1 軟件的功能描述及下載地址

1.2 系統(tǒng)的安裝和服務(wù)的配置［2，3］

采用光盤引導(dǎo)安裝。系統(tǒng)安裝完畢后，在 /etc/apt/sources.list中更改速度最快的更新源進(jìn)行系統(tǒng)升級(jí)。網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)的服務(wù)包括執(zhí)行Web服務(wù)的A-pache Web Server并配置CGI腳本支持。除此之外，要給執(zhí)行CGI的文件夾賦予相應(yīng)讀寫和運(yùn)行權(quán)限。為了方便管理，還需安裝 Webmin［4］，并配置 ufw實(shí)現(xiàn)防火墻功能，使用sudo ufw allow對(duì)內(nèi)網(wǎng)部分ip段開啟web服務(wù)端口。

安裝apache服務(wù):sudo apt－get install apache2安裝ufw防火墻:sudo apt－get install ufw

對(duì)CGI腳本的支持需要在httpd.conf配置文件中相應(yīng)目錄處添加下列代碼:

Options ExecCGI

AddHandler cgi－script cgi pl

1.3 WWW BLAST 的構(gòu)建［5，6，7，8］

1.3.1 Web 界面 Blast的配置

WWWBLAST是NCBI開發(fā)的一套使用廣泛的獨(dú)立 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部相似性比對(duì)搜索工具)程序，核酸和蛋白質(zhì)序列的相似性分析。包含在各種平臺(tái)下使用的版本。從表1給出的地址用wget下載并解壓至 /var/www/blast。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫(kù)的格式化

從 NCBI的 ftp 站點(diǎn) ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/中下載所需要的數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)于本地自建數(shù)據(jù)庫(kù)，先將fasta格式的序列寫入一個(gè)文件里面。使用formatdb命令對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行格式化，并在目錄下的配置文件blast.rc中添加格式化好的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)名稱，同時(shí)在網(wǎng)頁(yè)文件的源代碼中添加數(shù)據(jù)庫(kù)的鏈接和相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)名稱，為BLAST程序添加數(shù)據(jù)庫(kù)。核酸序列的格式化命令如下:

formatdb－p F －i nucleotide_db_name-o T/F

－p表示所要格式化的數(shù)據(jù)庫(kù)的類型，F(xiàn)表示nucleotide。

1.4 Primer3 的構(gòu)建［9］

在表1的Primer3地址中下載Primer3－core、primer3－web － htdpcs－0.3.0.tar.gz和 primer3 －web－ cgi－ bin －0.3.0.tar.gz，并別解壓在/var/www/primer3/htdocs、/var/www/primer3/cgi － bin和/var/www/primer3/cgi－bin/primer3－web－cgi－bin－0.3.0目錄中。運(yùn)行前需要從 http://cpan.org下載并安裝 perl的 cgi.pm模塊。配置 httpd.conf和增加文件夾權(quán)限使primer3中cgi－bin目錄能夠執(zhí)行CGI腳本。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物信息資源平臺(tái)的結(jié)構(gòu)

網(wǎng)站總體設(shè)計(jì)方案需要充分考慮到本地微生物科研的需求及可實(shí)現(xiàn)性。按照本地微生物科研需求，本平臺(tái)主要提供基于BLAST的在線序列比對(duì)和基于Primer3的在線引物設(shè)計(jì)，并配合Webmin實(shí)現(xiàn)圖形化的操作、配置和維護(hù)。整個(gè)平臺(tái)功能組成的層次結(jié)構(gòu)如圖2所示。

圖2 平臺(tái)的功能組成

微生物信息資源平臺(tái)的各種功能模塊通過Web服務(wù)集成在一個(gè)站點(diǎn)中，由發(fā)布的網(wǎng)站頁(yè)面鏈接集成，在瀏覽器地址欄中輸入站點(diǎn)ip訪問。平臺(tái)各模塊功能的實(shí)現(xiàn)均靠Web服務(wù)器的腳本程序，配合相互獨(dú)立的數(shù)據(jù)庫(kù)運(yùn)行。

2.2 Blast在線序列比對(duì)

比較和確定某一特定的序列在某一給定的數(shù)據(jù)庫(kù)中部分或全部序列的相似性是生物信息學(xué)中最基本和最有價(jià)值的工作［10］。BLAST是一套應(yīng)用廣泛的序列相似性比較的工具，基于啟發(fā)式的算法可以獲得序列匹配的近似最優(yōu)解，因而BLAST的最大優(yōu)勢(shì)在于運(yùn)行速度快。由于本地Blast針對(duì)核酸序列，因此去掉蛋白質(zhì)比對(duì)功能，模塊分為 BLASTN、TBLASTN、TBLASTX、MEGABLAST，其各部分的數(shù)據(jù)庫(kù)、檢索序列及功能注釋如表2所示。

表2 BLAST各種程序數(shù)據(jù)庫(kù)、檢測(cè)序列及其功能注釋

2.3 Primer3在線引物設(shè)計(jì)

Primer3由Whitehead Institute和Howard Hughes Medical Institute的Steve Rozen與Helen Skaletsky開發(fā)，是一款優(yōu)秀的批量設(shè)計(jì)PCR引物、雜交探針、測(cè)序引物的工具，可通過設(shè)定各種標(biāo)簽來指定引物設(shè)計(jì)參數(shù)，從而篩選 PCR目的引物，返回引物的相關(guān)信息。

進(jìn)入Primer3引物設(shè)計(jì)的界面，在“Paste source sequence below(5＇→3＇)”下面的文本框里面把模板序列5＇→3＇方向粘帖進(jìn)去，不用考慮數(shù)字或者空格。通過重要參數(shù)設(shè)定，如“Product Size Ranges”、“Primer Size”和“Primer Tm”，點(diǎn)擊 Pick primers獲得設(shè)計(jì)的引物。

2.4 平臺(tái)的維護(hù)和安全性

Webmin能更好的實(shí)現(xiàn)以圖形化界面的形式對(duì)操作系統(tǒng)及各種服務(wù)進(jìn)行配置和維護(hù)，從而簡(jiǎn)化了通過命令符對(duì)服務(wù)器進(jìn)行維護(hù)的過程。通過webmin對(duì)服務(wù)進(jìn)行配置和定時(shí)備份，可提高系統(tǒng)的穩(wěn)定性，同時(shí)簡(jiǎn)化維護(hù)過程。

ufw是Ubuntu系統(tǒng)的一個(gè)簡(jiǎn)易防火墻配置工具，底層調(diào)用 iptables處理，功能簡(jiǎn)單實(shí)用。通過Ubuntu的ufw服務(wù)，可限制平臺(tái)對(duì)外開放的端口以及訪問該平臺(tái)的IP段，增加了系統(tǒng)的安全性。

3 結(jié)論與討論

使用Ubuntu Server的Linux系統(tǒng)建立網(wǎng)絡(luò)科研平臺(tái)有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，Linux系統(tǒng)本身具有的穩(wěn)定性是諸如Windows等操作系統(tǒng)所無法超越的。另外，開源的軟件成本低，更新周期短。在開源環(huán)境下有豐富的開源軟件，其apt－get方式的軟件安裝和更新簡(jiǎn)化了系統(tǒng)的維護(hù)和軟件的安裝過程，因而使用Ubuntu作為本科研平臺(tái)的操作系統(tǒng)無疑是一個(gè)很好的選擇。

在局域網(wǎng)構(gòu)建Blast序列檢索對(duì)序列有較高的保密性，同時(shí)避免了網(wǎng)絡(luò)堵塞和延時(shí)，極大的縮短了序列比對(duì)操作所花費(fèi)的時(shí)間。而微生物信息資源平臺(tái)中所用的Blast數(shù)據(jù)庫(kù)從NCBI中鏡像得到，這種數(shù)據(jù)庫(kù)的鏡像操作與數(shù)據(jù)庫(kù)的實(shí)時(shí)更新存在一定的延時(shí)。另外，通過構(gòu)建具體的核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)或二次數(shù)據(jù)庫(kù)［11］，消除公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的冗余，可以進(jìn)行有目的、更精準(zhǔn)的比對(duì)，這樣會(huì)大大提高比對(duì)的目的性和結(jié)果的精確性?；赪eb的Primer3在線引物設(shè)計(jì)免去了安裝應(yīng)用程序的過程，直接可在線設(shè)計(jì)引物，并可結(jié)合本地的 BLAST功能對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證。

總之，在擁有一定規(guī)模的科研單位中構(gòu)建微生物信息資源平臺(tái)，對(duì)科研有著一定的支撐作用，簡(jiǎn)化科研過程中對(duì)于數(shù)據(jù)的處理和分析。通過將該系統(tǒng)與本實(shí)驗(yàn)室建立的微生物數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)聯(lián)，可以更好的對(duì)微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘和探索。

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