潘 輝 賀艷艷 李蓮瑞

Fas又稱APO－1，或者稱CD95分子，它屬于神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體/腫瘤壞死因子受體超家族成員［1］，是一種細(xì)胞凋亡信號(hào)受體，因此亦被成為死亡分子。Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑又被稱為細(xì)胞凋亡的外部途徑，目前發(fā)現(xiàn)的死亡受體可以分為三大類，F(xiàn)as是其中一種死亡受體的代表［2］。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞程序化死亡，它與免疫有著重要的關(guān)系。有病毒能夠通過(guò)誘導(dǎo)T細(xì)胞自身發(fā)生凋亡，從而達(dá)到免疫抑制的目的［3］。目前已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與多種免疫缺陷病及細(xì)胞增生性疾病有關(guān)［4］，但是不同信號(hào)通路引起的細(xì)胞凋亡所引起的疾病亦有所不同，這也極大程度的激發(fā)了研究者對(duì)細(xì)胞凋亡致病機(jī)理研究的熱情。

Fas通過(guò)與其配體的結(jié)合以達(dá)到引起細(xì)胞凋亡的目的，可以說(shuō)Fas是細(xì)胞凋亡的正控元件。FasL主要在活化的T淋巴細(xì)胞表面表達(dá)，F(xiàn)as與之結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是T細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞的主要途徑之一［5］。

中國(guó)卡拉庫(kù)爾羊?qū)儆谥泊置颍涓崞ぞ哂忻利惖拿?，在?guó)際市場(chǎng)享有盛譽(yù)，具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。同時(shí)，卡拉庫(kù)爾羊耐嚴(yán)寒、酷暑和干旱的大陸性氣候，非常適合在新疆地區(qū)養(yǎng)殖［6］。近幾年，高密度集約化的養(yǎng)殖模式引起一些嚴(yán)重的卡拉庫(kù)爾羊傳染病相繼出現(xiàn)，對(duì)畜牧業(yè)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

利用同源克隆技術(shù)，擴(kuò)增出卡拉庫(kù)爾羊Fas基因，通過(guò)核苷酸分析和序列比對(duì)可以從分子水平來(lái)了解卡拉庫(kù)爾羊Fas的特異性變化，為研究者從分子免疫學(xué)角度研究卡拉庫(kù)爾羊抗病力提供了理論基礎(chǔ)?？寺】ɡ瓗?kù)爾羊Fas基因?yàn)橹苽湎鄳?yīng)的核酸探針打下基礎(chǔ)，F(xiàn)as探針的制備能夠?yàn)榭ɡ瓗?kù)爾羊某些疾病的診斷作出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株、質(zhì)粒

卡拉庫(kù)爾羊由塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院試驗(yàn)站提供;菌株E.coli DH5α本實(shí)驗(yàn)室儲(chǔ)存、質(zhì)粒pMD18－T購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.1.2 試劑及酶

人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司;Trizol購(gòu)于invitrogen公司;Taq酶、T4 DNA連接酶、dNTP、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScript Revere Transcriptase購(gòu)自TaKaRa公司;限制性內(nèi)切酶購(gòu)自大連寶生物工程公司;DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成

根據(jù)GeneBank中綿羊的Fas基因序列全長(zhǎng)為976 bp(NM_001123003)設(shè)計(jì)卡拉庫(kù)爾羊Fas基因的一對(duì)引物PF、PR，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。為便于基因的克隆，在引物中引入了Eco R I和Xho I的酶切位點(diǎn)(以下劃線表示)。

1.2.2 卡拉庫(kù)爾羊淋巴細(xì)胞的提取

采集健康的卡拉庫(kù)爾羊血液10 mL，添加1 mL 3.8%枸櫞酸鈉溶液抗凝，然后將新鮮抗凝血11 mL.與Hank＇s液1:1稀釋混勻后，以2 mL/管的量分別置于玻璃離心管中，用移液槍吸取稀釋血液2 mL，沿管壁緩緩的疊加到1 mL人淋巴細(xì)胞分離液界面上，注意不要破壞分離液界面，以2000 r/min離心35 min后吸取淋巴細(xì)胞層［7］。

1.2.3 卡拉庫(kù)爾羊Fas基因的克隆

卡拉庫(kù)爾羊淋巴細(xì)胞總RNA提取按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。第一鏈cDNA的合成也按照PrimeScript Revere Transcriptase說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。然后以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在20μL的PCR體系中:10×one step RT－PCR buffer 2μL，dNTP 1.6 μL，引物 PF、PR 各0.5 μL，模板 cDNA 1 μL，Taq 酶 0.4 μL，ddH2O 14 μL。PCR 程序設(shè)定:95℃預(yù)變性5 min，1個(gè)周期;94℃變性30 s;60.9℃ 退火30 s，72℃延伸1 min20 s，循環(huán)35個(gè)周期;最后72℃延伸10 min。取10μL PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)。用DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的片段(操作見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))，參照克隆載體pMD18－T說(shuō)明書(shū)，構(gòu)重組質(zhì)粒 pMD18－T－Fas。將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和菌落PCR法初步鑒定后，再經(jīng)過(guò)雙酶切鑒定，將可能的陽(yáng)性克隆子送到上海生工生物工程技術(shù)有限公司測(cè)序，用DNA軟件分析測(cè)序結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Fas基因擴(kuò)增

從淋巴細(xì)胞中提取總RNA，進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

為了驗(yàn)證所得的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，將提取的pMD18T－Fas重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定。PCR結(jié)果出現(xiàn)大小約為994 bp片段(圖2)。由于在雙酶切時(shí)會(huì)切除保護(hù)性堿基形成黏性末端，結(jié)果pMD18T－Fas重組質(zhì)粒經(jīng)Eco R I和Xho I雙酶切后得到一個(gè)約為986 bp的片段(圖3)，上述獲得的片段大小均與預(yù)計(jì)相符。增，得到994 bp Fas目的基因(圖1)。

2.3 測(cè)序結(jié)果及分析比較

含有重組Fas基因的質(zhì)粒經(jīng)華大中生科技有限公司測(cè)序，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增的Fas基因?yàn)?94 bp，含有一個(gè)750 bp的開(kāi)放閱讀框，編碼了250個(gè)氨基酸，其中親水性氨基酸占36.8%，疏水性氨基酸占31.2%，堿性氨基酸占 18.4%，酸性氨基酸占13.6%，推斷的蛋白理論分子量為39.7 KDa。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的Fas基因?yàn)榘腴L(zhǎng)基因，未包含信號(hào)肽序列。7－49位、51－87位均為胞外區(qū)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)亞域，它是Fas與Fas L相互作用的部位，95－117的18個(gè)氨基酸構(gòu)成了氨基酸的跨膜區(qū);胞質(zhì)區(qū)則包含了一個(gè)由95個(gè)氨基酸構(gòu)成的死亡結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖4 擴(kuò)增序列包含的一個(gè)大小為750 bp的開(kāi)放閱讀框，對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，它包含完整的Fas基因胞外區(qū)(TNFR)，跨膜區(qū)，和胞質(zhì)區(qū)(死亡結(jié)構(gòu)域)。

物種間Fas基因的比較分析，將卡拉庫(kù)爾羊的Fas基因與其它物種的相對(duì)應(yīng)區(qū)域進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)卡拉庫(kù)爾羊Fas基因的核苷酸序列與參考序列NM_001123003同源性高達(dá)99.69%，與牛、豬、人的核苷酸序列同源性分別為 94.93%、75.52%、69.83%，其氨基酸同源性分別為 91.13%、69.11%、59.20%。

將各物種Fas的氨基酸序列比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，由圖可以看出Fas蛋白與同是反芻類的羊和牛同源性最近，與嚙齒類動(dòng)物的小鼠同源性較遠(yuǎn)。

3 討論

3.1 經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的Fas基因?yàn)榘腴L(zhǎng)基因，未包含信號(hào)肽序列。7－49位、51－87位均為胞外區(qū)富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)亞域，它是Fas與Fas L相互作用的部位，F(xiàn)as及FasL是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，是細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要介質(zhì)，其涉及到自身免疫、驗(yàn)證組織損傷等病理?yè)p傷［8］。95－117的18個(gè)氨基酸構(gòu)成了氨基酸的跨膜區(qū);胞質(zhì)區(qū)則包含了一個(gè)由95個(gè)氨基酸構(gòu)成的死亡結(jié)構(gòu)域。Fas的死亡結(jié)構(gòu)域在Fas與Fas結(jié)合后形成三聚體的活化形式，隨后引起與之結(jié)合的Fas相關(guān)死亡受體蛋白(FADD)的構(gòu)想發(fā)生變化，從而啟動(dòng)白介素1β轉(zhuǎn)化酶(ICE)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致凋亡［9－10］。

3.2 將各物種Fas的氨基酸序列比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，由圖可以看出Fas蛋白，同反芻類的羊和牛同源性最近，與嚙齒類動(dòng)物的小鼠同源性較遠(yuǎn)。

圖5 使用MEGA 4.0的Neighbor－joining算法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)

3.3 目前許多傳染病在影響著養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，通過(guò)研究宿主細(xì)胞對(duì)外來(lái)病原微生物的反應(yīng)機(jī)制，探討防治傳染病的新途徑，有助于提高養(yǎng)羊業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益［11］。因此，采用RT－PCR技術(shù)克隆了卡拉庫(kù)爾羊Fas基因，為進(jìn)一步制備探針來(lái)檢測(cè)Fas基因在卡拉庫(kù)爾羊的細(xì)胞中的表達(dá)動(dòng)態(tài)，對(duì)了解病毒與細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為新的抗病毒策略提供思路。

［1］ 趙艷.死亡分子 Fas/CD95與細(xì)胞凋亡［J］.癌變·畸變· 突變，2001，3(1):55 －57.

［2］ Fiona L.Boguslaw S，Cristina P，et al.The Fas-FADD death domain complex structure unravels signalling by receptor clustering［J］.Nature，2009;457(7232):1019－22.

［3］ Hamel W Mangnelli L，Chiarugi VP，et al.Herpes Simplex Virus Thymidine Kinase/Ganciclovir－mediated Apoptotic Death of Bystander Cells［J］.Cancer Res ，1996 ，56(12):2697 －2702.

［4］ 龍塔，楊自軍，董發(fā)明.動(dòng)物細(xì)胞凋亡與疾病的發(fā)生［J］.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，23(3):38 －41.

［5］ 郭梁，吳榮聰，王釗.與CD95相關(guān)的細(xì)胞凋亡和免疫調(diào)節(jié)［J］.生命的化學(xué)，2002，22(2):106－09.

［6］ 李蓮瑞，陳根元，王曉斌.新疆卡拉庫(kù)爾羊的研究現(xiàn)狀及前景［J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2008，28(2):63－64.

［7］ 賀艷艷 ，潘輝 ，劉書(shū)東等.新疆多浪羊淋巴細(xì)胞分離和培養(yǎng)［J］.塔里木大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，22(4):11 －14.

［8］ 唐恩潔，楊宗琪，趙明才.用人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)制備Dig－Fas探針［J］.川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，15(3):1－3

［9］ 嚴(yán)玉霖，高洪，翁銀標(biāo).Fas在內(nèi)毒素致大鼠肝細(xì)胞凋亡中的作用［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2010，40(01):75－78.

［10］ Imtiyaz.H Z，Rosenberg SThe Fas－Associated Death Domain Protein Is Required in Apoptosis and TLR－Induced Proliferative Responses in B Cells.［J］Expand The Journal of Immunology，2006，176:6852－6861

［11］ 李軍，李曉寧，楊堅(jiān).豬F a s基因的克隆及序列分析［J］.廣 西 農(nóng) 業(yè) 生 物 科 學(xué)，2006，5(1):6 －9.