金 鑫，曲 佳，李時(shí)放

(1.天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院，天津 300052； 2.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

麻仁膠囊由熟大黃、火麻仁、苦杏仁、枳實(shí)、厚樸、白芍共6味中藥組成，具有潤(rùn)腸通便的功效，用于腸燥便秘等癥。處方中大黃具有瀉熱通腸，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)等功效，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部部標(biāo)準(zhǔn)WS3-41(X-32)-93(Z)，其中無(wú)含量測(cè)定，故采用HPLC法，以大黃素、大黃酚為定量指標(biāo)，建立了處方中大黃的含量測(cè)定方法。修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、專屬性及重現(xiàn)性好，可用于麻仁膠囊的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

日本SHIMADZU LC-2010CHT高效液相色譜儀，LC-solution工作站。大黃素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)1100756-200110，為含量測(cè)定用)；大黃酚對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)110796-200615，為含量測(cè)定用)。麻仁膠囊(規(guī)格：0.35 g/粒，批號(hào)061001、061002、061201、070101、070201、071201、080101、080102、080301、080401)，甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為去離子水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Sepax Sapphire-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；流動(dòng)相：甲醇-0.1 %磷酸溶液(85∶15)；柱溫：40 ℃；流速：1.0 ml/min；理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算為13 716，分離度為5.5。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備 分別取大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加乙酸乙酯-無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液制成每1 ml含大黃素10 μg、含大黃酚15 μg的混合溶液，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 取“裝量差異”項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)欲}酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴?無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液的制備 按處方配比，取除大黃外的其他藥材，按處方工藝制成制劑，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制得陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析。結(jié)果陰性對(duì)照樣品在大黃素、大黃酚相應(yīng)的保留時(shí)間處未見色譜峰。結(jié)果表明，陰性對(duì)照樣品對(duì)檢測(cè)無(wú)干擾，結(jié)果見圖1。

2.3線性關(guān)系考察 分別取大黃素、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含大黃素分別為0.00075525、0.0015105、0.00377625、0.0075525、0.01132875、0.015105、0.01888125 mg，還分別含大黃酚為0.001578、0.003156、0.00789、0.01578、0.02367、0.03156、0.03945 mg的混合溶液，作為儲(chǔ)備液，分別精密吸取上述7種濃度的對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按“2.1”色譜條件分析，測(cè)定各自峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積值為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y大黃素=4.0×106X-4.8×102(r=1.000 0)；Y大黃酚=5.4×106X-5.2×102(r=1.000 0)。結(jié)果表明大黃素在0.007 552 5～0.188 812 5 μg范圍內(nèi)線性良好；大黃酚在0.015 78～0.394 5 μg范圍內(nèi)線性良好。

1.大黃素 2.大黃酚

2.4精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取1份，按照“2.2.2”方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中大黃素、大黃酚的峰面積，結(jié)果大黃素峰面積值的RSD為0.1%；大黃酚峰面積值的RSD為0.1%。

2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取6份，按照“2.2.2”供試品溶液制備方法操作，按“2.1”色譜條件分析，測(cè)定每份樣品中大黃素、大黃酚的含量。結(jié)果6份樣品中大黃素的平均含量為2.3597 mg/g，RSD為2.9%；大黃酚的平均含量為5.6964 mg/g，RSD為1.1%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取1份，按照“2.2.2”供試品溶液制備方法操作，按“2.1”色譜條件分析，分別在0、2、4、6、8、10、12 h測(cè)定樣品中大黃素、大黃酚峰面積，結(jié)果大黃素峰面積值的RSD為0.3%；大黃酚峰面積值的RSD為0.1%。結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7回收率試驗(yàn) 取同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.35 g，共6份，精密稱定，分別精密加入每1 ml含大黃素對(duì)照品0.023 62 mg、含大黃酚對(duì)照品0.057 44 mg的混合對(duì)照品甲醇溶液50 ml，再按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備操作，制得供試品溶液，按“2.1”色譜條件分析，計(jì)算回收率，結(jié)果大黃素平均回收率為99.58%，RSD為0.74%；大黃酚平均回收率為98.98%，RSD為1.83%，結(jié)果見表1和表2。

表1 大黃素加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=6)

表2 大黃酚加樣回收試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.8樣品測(cè)定 取10個(gè)批號(hào)的樣品，按照“2.2.2”供試品溶液制備操作，按“2.1”色譜條件分析，測(cè)定樣品中大黃素、大黃酚的含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1波長(zhǎng)的選擇 通過(guò)對(duì)大黃素對(duì)照品溶液在200～400 nm處進(jìn)行紫外光譜掃描檢測(cè)顯示，大黃素、大黃酚在254 nm處有最大吸收，與文獻(xiàn)[1]采用的波長(zhǎng)基本相同。

3.2提取方法的選擇

3.2.1提取方式的選擇 取“裝量差異”項(xiàng)下同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱重，分別采用超聲處理與加熱回流的方式，提取時(shí)間均為45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)欲}酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴?無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果顯示，提取溶劑為甲醇，采用加熱回流方式(7.969 2 mg/g)高于超聲處理方式(6.576 0 mg/g)，故將提取方式定為加熱回流。

3.2.2提取溶劑用量的選擇 取“裝量差異”項(xiàng)下同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇25、50、100 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)欲}酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴?無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和。加入25.50、100 ml甲醇提取后大黃素和大黃酚含量之和分別為7.765 0、7.931 5和7.597 1 mg/g。結(jié)果顯示，加入甲醇50 ml高于其他兩種溶劑量，故將提取溶劑量定為50 ml，可將所測(cè)成分提取完全。

3.2.3提取時(shí)間的選擇 取“裝量差異”項(xiàng)下同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，精密稱取0.7 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇15 ml，稱重，分別加熱回流15、30、60 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)欲}酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴?無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和。結(jié)果15、30、60 min提取的大黃素和大黃酚的含量之和分別為7.440 2、7.469 3和7.494 4 mg/g。30 min與60 min測(cè)定結(jié)果的相對(duì)平均偏差為0.17%，認(rèn)為30 min提取時(shí)間可行，故將提取時(shí)間定為30 min。結(jié)果見表9。

3.2.4提取酸度的選擇 取“裝量差異”項(xiàng)下同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)謩e加鹽酸-30 %乙醇溶液(1∶10)、(3∶10)混合溶液各15 ml，置水浴中加熱水解50 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴?無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和。結(jié)果顯示，采用鹽酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液(7.609 7 mg/g)高于(1∶10)的混合溶液(7.383 5 mg/g)，故將提取酸度定為(3∶10)，可將所測(cè)成分提取完全。

3.2.5酸水解時(shí)間的選擇 取“裝量差異”項(xiàng)下同一批號(hào)(071201)樣品內(nèi)容物，研細(xì)，取0.7 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入甲醇50 ml，稱重，加熱回流30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液5 ml，蒸干，殘?jiān)欲}酸-30%乙醇溶液(3∶10)混合溶液各15 ml，置水浴中分別加熱水解30、50、90 min，用三氯甲烷振搖提取5次，每次15 ml，合并三氯甲烷液，蒸干，殘?jiān)靡宜嵋阴?無(wú)水乙醇(1∶2)混合溶液溶解，置25 ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，測(cè)定樣品中大黃素與大黃酚的含量之和酸水解30、50和90 min，樣品中大黃素和大黃酚的含量之和分別為7.609 7、7.853 1和7.977 3 mg/g。結(jié)果顯示，酸水解50 min與90 min，提取大黃素與大黃酚總量基本一致，二者RAD為0.78%，故將酸水解時(shí)間定為50 min，可將所測(cè)成分提取完全。且采用三氯甲烷萃取5次后，已將大黃素、大黃酚萃取完全。

3.3耐用性試驗(yàn)

3.3.1不同色譜柱對(duì)含量測(cè)定的影響 取批號(hào)為071201的樣品，制成供試品溶液，分別用Sepax Sapphire-C18、Phenomenex-C18色譜柱，采用SHIMADZU-LC-2010CHT高效液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件，測(cè)定樣品中大黃素、大黃酚含量之和分別8.060 2和8.153 3 mg/g，二者RAD為0.09%。

3.3.2不同儀器對(duì)含量測(cè)定的影響 取批號(hào)為071201的樣品，制成的供試品溶液，用色譜柱，分別采用SHIMADZU-LC-2010CHT與SHIMADZU LC-2010C高效液相色譜儀，按照“2.1”色譜條件分析，測(cè)定樣品中大黃素、大黃酚含量之和分別為8.060 2和7.943 0 mg/g，二者RAD為0.73%。結(jié)果顯示，采用相同儀器，不同色譜柱，與采用相同色譜柱，不同儀器對(duì)測(cè)定結(jié)果均無(wú)影響。因此，建立的該含量測(cè)定方法耐用性良好，具有可行性。

1 中國(guó)藥典.一部.2005：603