徐廷川，王 衡，張得玉，張桂紅

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642）

豬圓環(huán)病毒病是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV－2）引起的單獨(dú)或繼發(fā)／混合感染其他致病微生物的一系列疾病的總稱，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰弱綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、新生仔豬先天性震顫（Congenital tremors，CT）、豬增生性壞死性間質(zhì)性肺炎（Interstitial pneumonia，IP）以及懷孕母豬的繁殖障礙等［1］。PCV－2、豬繁殖與呼吸道綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）和偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）的混合感染已經(jīng)成為PMWS陽(yáng)性豬的主要致病因素，以兩病毒混合感染的比例很高，在德國(guó)高達(dá)75.9%，美國(guó)60%［2］，中國(guó)30%左右［3］。近年來，該病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在引起免疫抑制的同時(shí)，還容易繼發(fā)、并發(fā)一系列疾病，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重制約了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，已成為豬群的又一重要免疫抑制?。?］。為了解廣東省豬PCV－2的感染及與PRV或PRRSV混合感染情況，在2007年—2011年，采用PCV－2ELISA診斷試劑盒對(duì)該地區(qū)豬血清PCV－2抗體進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)該病毒與高致病性與低致病性PRRSV、PRV等混合感染情況進(jìn)行了相關(guān)調(diào)查，旨在了解廣東省PCV－2的感染情況，為廣東省防控PCV－2的感染，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1豬血清和病料樣本收集 分別在江門、佛山、惠州、深圳、肇慶等地區(qū)隨機(jī)選擇15個(gè)豬場(chǎng)（均未免疫商品化豬圓環(huán)病毒疫苗），對(duì)選定的豬場(chǎng)采用分層隨機(jī)抽樣方法，按5%的比例隨機(jī)采集不同年齡段的豬的血清。從豬耳靜脈或前腔靜脈采血，分離血清，4℃保存?zhèn)溆?。采集送檢疑似PCV－2豬的脾、肺、腎、肝、淋巴結(jié)等組織，研磨后，置－20℃保存?zhèn)溆?。PCV－2、PRV、PRRSV陽(yáng)性對(duì)照株由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院傳染病研究室分離并保存。

1.1.2 試劑盒 PCV－2抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；gpI－PRV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；PRRSV抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京IDEXX元亨生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；Trizol Reagent為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶AMV、RNA酶抑制劑（Ribonuclease inhibitor）、TaqTMDNA 聚合酶、dNTP Mixture（2.5and 10mmol／L）、DNA Marker DL 2 000均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑，如氯仿、無水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 ELISA檢測(cè) 將采集的各豬場(chǎng)的血清進(jìn)行PCV－2抗體檢測(cè)，檢測(cè)PCV－2、PRV、PRRSV抗體具體操作及結(jié)果判定按說明書進(jìn)行。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表PCV－2核苷酸全序列（AY188355）、PRRSV核苷酸全序列（AY032626）、PRV 核苷酸全序列（BK001744）分別設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物［5－7］（表1）。

1.2.3 抗原檢測(cè) 送檢病料研磨后按上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司試劑盒說明書提取病毒DNA，參照Invitrogen公司的Trizol試劑說明書提取病毒RNA。

應(yīng)用相應(yīng)的 PCV－2、PRV、PRRSV 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用25μL體系：10×PCR buffer（Mg2＋Plus）2.5μL；dNTP（2.5mmol／L）2.5μL；上、下游引物（25pmol／μL）各0.25μL，TaqTM DNA 聚合酶0.25μL，DNA／cDNA 2μL，滅菌雙蒸水17.25 μL。PCV－2PCR擴(kuò)增條件為：95℃3min后，按94℃45s，54℃40s，72℃1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；PRV PCR擴(kuò)增條件為：95℃4 min后，按94℃40s，53℃40s，72℃1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min；PRRSV PCR擴(kuò)增條件為：94℃5min后，按94℃45s，50℃30s，72℃50min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取PCR產(chǎn)物5μL，用10g／L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 材料中所有數(shù)據(jù)均用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。不同生長(zhǎng)階段、不同地區(qū)PCV－2陽(yáng)性率均采用卡方檢驗(yàn)，PCV－2感染與PRRSV和PRV免疫應(yīng)答率進(jìn)行相關(guān)性分析，PCV－2感染率與PRRSV感染率之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

表1 PCV－2、PRRSV和PRV引物序列Table 1 Primer sequence of PCV－2、PRRSV and PRV

2 結(jié)果

2.1 豬場(chǎng)及豬群的PCV－2陽(yáng)性率

對(duì)來自廣東省15個(gè)豬場(chǎng)2007年—2011年764份血清樣品進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，所有被檢測(cè)豬場(chǎng)均存在PCV－2感染，豬場(chǎng)的抗體陽(yáng)性率為100%（15／15），全部豬的PCV－2平均抗體陽(yáng)性率為61.91%（473／764）（表2）。

2.2 不同年齡段豬的PCV－2抗體陽(yáng)性率

種公豬的PCV－2抗體陽(yáng)性率為70.97%（22／31），經(jīng)產(chǎn)母豬的抗體陽(yáng)性率為67.29%（72／l07），后備母豬的抗體陽(yáng)性率為64.81%（35／54），斷奶仔豬的抗體陽(yáng)性率為59.52%（322／541）。對(duì)種公豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和斷奶仔豬進(jìn)行卡方分析，發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)階段豬的PCV－2抗體陽(yáng)性率差異極顯著（P＜0.01）。進(jìn)行趨勢(shì)卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PCV－2的抗體陽(yáng)性率隨著年齡增長(zhǎng)而升高，并且相關(guān)性顯著（P＜0.01）（表3）。

2.3 部分豬場(chǎng)PRV和PRRSV抗體檢測(cè)結(jié)果

PRV檢測(cè)是采用PRV gpI抗體檢測(cè)試劑盒，可以區(qū)分野毒感染和疫苗免疫抗體。由結(jié)果可知，PCV－2的感染率和PRV的感染率息息相關(guān)，不僅能引起豬繁殖障礙性疾病，同時(shí)也是引起豬呼吸道疾病綜合征的主要原發(fā)病因，PCV－2陽(yáng)性率高的豬場(chǎng)，PRV的陽(yáng)性率也很高。PCV－2陽(yáng)性的豬群PRRSV抗體陽(yáng)性率也很高，這可能與豬場(chǎng)主動(dòng)免疫有關(guān)，也有可能是豬場(chǎng)曾經(jīng)或正在感染PRRSV（表4）。

表2 不同豬場(chǎng)豬群的PCV－2抗體檢測(cè)Table 2 Antibody positive rate of different pig farms

表3 不同生長(zhǎng)階段豬的PCV－2抗體檢測(cè)Table 3 Detection results of PCV－2antibody from different growth phases of pigs

表4 部分豬場(chǎng)PRV和PRRSV抗體檢測(cè)Table 4 Detection results of PRV and PRRSV antibodies from part of pig farms

2.4 部分豬場(chǎng)PCV－2、PRV和PRRSV檢測(cè)結(jié)果

PCV－2、PRV、PRRSV 病原檢測(cè)采 用特異性PCR方法，結(jié)果見表5。由檢測(cè)結(jié)果可見，總共檢測(cè)豬頭數(shù)為238頭，其中PCV－2陽(yáng)性率為75.21%（179／238），與 PRV 混合感染陽(yáng)性率為14.71%（35／238），與 PRRSV 混合感染陽(yáng)性率為47.48%（113／238），PCV2、PRRSV 和 PRV 三者混合感染的陽(yáng)性率為8.82%（21／238）。PRRSV 陽(yáng)性中71頭是變異株感染，變異株占PRRSV陽(yáng)性感染的62.83%（71／113）。

表5 部分豬場(chǎng)PCV－2、PRV和PRRSV病原檢測(cè)Table 5 Detection results of in PCV－2，PRV and PRRSV in part of pig farms

2.5 PCV－2、PRV、PRRSV擴(kuò)增結(jié)果

從2007年－2011年采集的部分組織樣品中檢測(cè)PCV－2、PRRSV、PRV，其PCR擴(kuò)增片段大小分別為651、596、267bp（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 部分樣品PCV－2（A）、PRRSV（B）、PRV（C）電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCV－2（A）、PRRSV（B），PRV（C）PCR products in part of samples

3 討論

全世界許多國(guó)家和地區(qū)的豬群中都存在著PCV－2，但其流行情況不盡相同。此次檢測(cè)的我國(guó)廣東省15個(gè)豬群，既有國(guó)外引進(jìn)的純種豬，也有國(guó)內(nèi)種豬；既有斷奶仔豬，又有后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬，因而具有一定代表性。本研究中被檢測(cè)豬場(chǎng)均存在PCV－2感染，PCV－2的總抗體陽(yáng)性率為61.91%（473／764），這與郎洪武等［8］報(bào)道的全國(guó)7個(gè)養(yǎng)豬大省42.9%的總陽(yáng)性率相比，要高出19個(gè)百分點(diǎn)；較趙東升等［9］報(bào)道的全國(guó)（2002年－2007年）PCV－2血清抗體總陽(yáng)性的平均水平38.47%要高出23.4個(gè)百分點(diǎn)。表明廣東被調(diào)查地區(qū)的PCV－2感染已經(jīng)較普遍，可能與引種不規(guī)范、飼養(yǎng)管理水平低下等方面原因有關(guān)，需要引起高度重視。

調(diào)查結(jié)果表明，受檢豬群斷奶仔豬、后備母豬、經(jīng)產(chǎn)母豬和種公豬的PCV－2感染陽(yáng)性率較高。由此推測(cè)，豬群中PCV－2感染比例隨著豬生長(zhǎng)日齡的增加而升高，與郎洪武等［8，10－11］報(bào)道的結(jié)果相似。

近年來，隨著規(guī)模化養(yǎng)豬的不斷發(fā)展，在豬群中存在PCV－2、PRRSV、PRV及豬附紅細(xì)胞體等病原的感染，且混合感染比較普遍，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害正日益加劇［12－13］。本研究對(duì)所有 PCV－2抗體陽(yáng)性血清樣品與PRV及PRRSV混合感染的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，存在PRRSV（47.48%）、PRV（14.71%），這與萬根等［14－15］報(bào)道的 PCV－2抗體陽(yáng)性率均不同程度地存在PRRSV（43.75%）、PRV（17%～19%）相一致，其相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過對(duì)來自廣東省的豬血清樣本和病料樣品進(jìn)行PCV－2抗體和其他病原混合感染的檢測(cè)，系統(tǒng)分析了PCV－2在豬群中的感染及流行規(guī)律，為開展PCV－2所致疾病的診斷與防控奠定了基礎(chǔ)。

［1］Chae C.A review of porcine circovirus 2－associated syndromes and diseases［J］.Vet J，2005，169（3）：326－336.

［2］Krakowka S，Ellis J A，Neilly F，et al.Immunologic feature of porcine circovirus type 2infection［J］.Viral Immunol，2002，15：567－582.

［3］王天戶，婁中子，劉思當(dāng).豬PRRSV單獨(dú)感染及與PCV2混合感染的免疫病理學(xué)研究［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（1）：187－190.

［4］Schibahara G W，Kiupel M ，Mittal S K.Tissue distribution and genetic typing of porcine circoviruses in pigs with naturally occurring congenital tremors［J］.J Vet Diagn Invest，2001，13（1）：57－62.

［5］Fernandez J，Navasa M，Gomez J，et al.Bacterial infections in cirrhosis：Epidemiological changes with invasive procedures and norfloxacin prophylaxis［J］.Hepatology，2002，35（1）：140－148.

［6］魏 宏，林鋒強(qiáng).豬繁殖障礙與呼吸道綜合征病毒福州株ORF2－7基因結(jié)構(gòu)分析［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2007，34（1）：82－85.

［7］Chiou M T，Yang C Y，Chang T C，et al.Shedding pattern and serological profile of porcine circovirus type 2infection in cesarean－derived，colostrum－deprived and farm－raised pigs［J］.J Vet Med Sci，2011，73（4）：521－525.

［8］郎洪武，張廣川，吳發(fā)權(quán)，等.斷奶豬多系統(tǒng)衰弱綜合征血清抗體檢測(cè)［J］.中國(guó)獸醫(yī)科技，2000，30（3）：3－5.

［9］趙東升，劉有昌，安福生，等.近年來我國(guó)豬圓環(huán)病毒病的流行狀況及分析［J］.養(yǎng)豬，2009，（1）：57－59.

［10］吳 瑗，王燕麗，李君榮.用ELISA法對(duì)金華地區(qū)豬圓環(huán)病毒的血清學(xué)調(diào)查［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2011（9）：117－118.

［11］薛 霞，孫泉云，沈 悅，等.上海市規(guī)?；i場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型血清學(xué)調(diào)查［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2006，27（8）：102－104.

［12］Opriessnig T，Meng X J，Halbur P G.Porcine circovirus type 2－associated disease update on current terminology，clinical manifestations，pathogenesis，diagnosis and intervention strategies［J］.Vet Diagn Invest，2007，19（9）：591－615.

［13］蔣大良，余興龍.豬圓環(huán)病毒2型致病機(jī)制研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（4）：77－82.

［14］萬 根，陶清松，龔國(guó)建，等."豬高熱病"中豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型的檢測(cè)分析［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2010（5）：5－7

［15］戴愛玲，李曉華，黃思瓊，等.福建省龍巖市規(guī)?；i場(chǎng)偽狂犬野毒感染的血清學(xué)調(diào)查［J］.龍巖學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，29（2）：79－82.