劉義梅 羅焜 陳科力 陳士林

小茴香為臨床常用中藥，傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認(rèn)為其具有散寒止痛、理氣和胃的功效[1]。本品來源于傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果實(shí)，有些地區(qū)把同科植物蒔蘿AnethumgraveolensL.、毒芹CicutavirosaL.、孜然芹CuminumcyminumL.、防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata(Turcz.) Schischk、葛縷子CarumcarviLinn.的果實(shí)作為小茴香藥用[2-5]。這5種混偽品與正品小茴香同樣來源于傘形科植物的果實(shí)，在形態(tài)上同為雙懸果，都具有特異香氣且顯微特征同樣具有油室或者油管等，傳統(tǒng)的經(jīng)典鑒定方法難以準(zhǔn)確鑒定。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA條形碼技術(shù)以其不受被檢測(cè)對(duì)象的形態(tài)特征以及發(fā)育階段影響等優(yōu)點(diǎn)而為中藥鑒定領(lǐng)域所關(guān)注，其熱點(diǎn)候選序列—ITS2已被證明在藥用植物鑒定方面具有潛在的研究?jī)r(jià)值[6-11]，本研究運(yùn)用ITS2序列鑒定小茴香及其常見混偽品，為小茴香藥材的快速和準(zhǔn)確鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)采集小茴香4個(gè)樣本，材料經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖副研究員鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，見表1。其余42個(gè)樣本6個(gè)物種來源于GenBank，見表2。

1.2 DNA提取和PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化及序列測(cè)定

樣品的DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序的方法均參照文獻(xiàn)[7]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序獲得的峰圖利用CondonCode Aligner V 3.7.1(CodonCode Co.,USA)校對(duì)拼接。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與GenBank上下載的ITS2序列采用基于隱馬爾可夫模型的HMMer注釋方法去除兩端5.8S和26S，獲得ITS2間隔區(qū)序列。通過MEGA4.1軟件對(duì)小茴香不同樣本進(jìn)行種內(nèi)序列對(duì)比，計(jì)算小茴香的種內(nèi)最大K-2-P距離和種間最小K-2-P距離，并構(gòu)建其NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。利用Schultz等人[12]的研究方法預(yù)測(cè)各物種ITS2莖環(huán)二級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序峰圖

實(shí)驗(yàn)序列JF421497的峰圖(見圖1)，其序列長(zhǎng)度為222 bp，其中221個(gè)堿基的Q值均大于等于20，具有1個(gè)POLY(C)和1個(gè)POLY(T)結(jié)構(gòu)，GC含量為55.1%。

圖1 實(shí)驗(yàn)序列JF421497的峰圖

2.2 小茴香不同樣本種內(nèi)序列比對(duì)

通過比對(duì)17個(gè)小茴香樣本的ITS2序列，結(jié)果顯示JF421497、HQ377209、HQ377210、HQ377211、HQ377212、HQ377213、HQ377215、GQ434700、GQ434701、GQ148792、GQ148793、AY581806、FJ980396這11條序列完全相同，HQ377206和HQ377208完全相同，17個(gè)樣本有4種不同的序列，這4個(gè)不同序列的長(zhǎng)度為219～222 bp，具有1個(gè)POLY(C)和1個(gè)POLY(T)結(jié)構(gòu)，GC含量為54.3%-54.9%，平均GC含量為54.8%，共有10個(gè)堿基變異，平均K-2P距離為0.0044，種內(nèi)最大K-2P距離為0.0307。見圖2。

表1 實(shí)驗(yàn)材料采集地及GenBank登錄號(hào)

表2 GenBank下載樣本物種信息

圖2 不同樣本小茴香的種內(nèi)序列比對(duì)

2.3 小茴香與易混偽品的種間序列比對(duì)

從圖3中可以看出，小茴香及其5種混偽品的種間序列共有89個(gè)位點(diǎn)變異，信息位點(diǎn)有37個(gè)。小茴香及其同屬易混偽品的種間平均K-2-P距離為0.2479，最小K-2-P距離為0.0405。

2.4 ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

如圖4所示，小茴香與其5個(gè)混偽品在二級(jí)結(jié)構(gòu)上有明顯差異。重點(diǎn)差異存在于螺旋I和螺旋III中。小茴香二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋I存在7個(gè)小莖環(huán)和1個(gè)大莖環(huán)，蒔蘿為4小莖環(huán)和1個(gè)大莖環(huán)，葛縷子為4個(gè)小莖環(huán)和2個(gè)大莖環(huán)，孜然芹為4個(gè)小莖環(huán)，毒芹和防風(fēng)為6小莖環(huán)和1個(gè)大莖環(huán)。茴香二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋III的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與其他物種也存在明顯不同，正偽品ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋(Helix)區(qū)之間的反轉(zhuǎn)角度也各不相同。因此，ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)也可作為鑒定小茴香及其混偽品的一個(gè)方法。

圖3 小茴香與易混偽品的種間比對(duì)

圖4 小茴香及其五種混偽品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.5 小茴香及其混偽品的ITS2序列NJ樹鑒定

圖5 基于ITS2序列構(gòu)建的小茴香及其混偽品的鄰接(NJ)樹(bootstrap1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%，采用k-2p距離法)

從基于ITS2構(gòu)建的NJ樹圖可以看出，小茴香具有單系性，不同個(gè)體聚在一起，同時(shí)也很容易與其混偽品區(qū)別開來。因此ITS2序列適用于藥材小茴香與其混偽品的鑒定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小茴香核基因序列進(jìn)行研究，顯示ITS2序列在小茴香基源植物鑒定方面具有以下特點(diǎn)：小茴香ITS2序列較短，約為220 bp，降低了提取、擴(kuò)增和測(cè)序的難度，此特性也將更有利于獲取發(fā)生降解的樣本序列，對(duì)于DNA條形碼技術(shù)在中藥材應(yīng)用具有重要的意義；通過對(duì)小茴香及其混偽品數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)17樣本ITS2序列種內(nèi)最大K-2-P距離小于種間最小距離。同時(shí)，從基于ITS2序列構(gòu)建的小茴香及其易混品NJ樹可以看出，小茴香17個(gè)樣品聚為一支，支持率為97，明顯與其常見混偽品分開。說明通過ITS2序列能很好的區(qū)分小茴香及其混偽品；小茴香及其混偽品的ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)，都存在4個(gè)螺旋區(qū)域，各螺旋上的莖環(huán)，以及彼此間的夾角存在明顯的不同，也說明ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于鑒定小茴香及其混偽品。

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