曾旭 李莉 業(yè)寧 姚輝 劉志華 秦民堅(jiān)

2010版《中國(guó)藥典》規(guī)定威靈仙為毛茛科植物威靈仙ClematischinensisOsbeck，棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮ClematishexapetalaPall.或東北鐵線(xiàn)蓮ClematismanshuricaRupr.的干燥根及根莖[1]。威靈仙具有祛風(fēng)濕，通經(jīng)止痹痛等功效，凡風(fēng)濕痹痛，麻木不仁，無(wú)論上下，皆可應(yīng)用，是治療風(fēng)濕痹痛的要藥。作為中國(guó)常用中藥由于用藥歷史悠久，分布范圍廣泛，地區(qū)用藥習(xí)慣差異較大，威靈仙藥材使用混亂現(xiàn)象十分嚴(yán)重。北方常見(jiàn)百合科菝葜屬Smilax植物作威靈仙入藥，而南方常見(jiàn)以毛茛科鐵線(xiàn)蓮屬Clematis植物作威靈仙入藥[2,3]。云南部分地區(qū)菊科植物顯脈旋復(fù)花InulaneruosaWall.的根莖及根作威靈仙入藥。四川地區(qū)，金粟蘭科植物草珊瑚Sarandraglabra(Thunb.)NaRai的干燥根莖及全草作銅腳威靈仙入藥[4]。由于缺乏專(zhuān)業(yè)的鑒定人員加之市場(chǎng)需求量大致使威靈仙藥材常借不應(yīng)求，廣東地區(qū)曾發(fā)生過(guò)威靈仙與桃耳七混用的情況，造成數(shù)十人中毒的嚴(yán)重后果[5]。也曾出現(xiàn)過(guò)將毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥須根加工染色來(lái)冒充威靈仙使用[6]。由此我們急需一種迅速、簡(jiǎn)便有效的方法來(lái)鑒別威靈仙藥材與其混偽品，為保證藥材的真實(shí)性和指導(dǎo)臨床用藥安全提供科學(xué)依據(jù)，有必要對(duì)威靈仙正品來(lái)源與其各地混用品種進(jìn)行鑒別研究。

DNA條形碼(DNA barcoding)是近年來(lái)生物分類(lèi)和鑒定的研究熱點(diǎn)和方向，該技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)的、相對(duì)較短的DNA片段來(lái)對(duì)物種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。通過(guò)種間具有足夠的變異、種內(nèi)特異性而創(chuàng)建的一種新的生物身份識(shí)別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)物種的快速自動(dòng)鑒定[7,8]。自2003年由加拿大分類(lèi)學(xué)家PaulHebert首次選取以線(xiàn)粒體細(xì)肥色素C氧化酶亞基(COI)對(duì)動(dòng)物物種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無(wú)論在哪個(gè)分類(lèi)水平上該基因都具有良好的識(shí)別能力，該技術(shù)得到了各國(guó)專(zhuān)家的廣泛關(guān)注[9,10]。對(duì)于植物來(lái)說(shuō)，通用的DNA條形碼序列仍未最終確定世界各地者都稱(chēng)極投入到植物通用條形碼的研究當(dāng)中，得到了初敊的可喜成果。陳士林課題組選取真核生物rDNA位于5.8S和26S rRNA之間的一段順?lè)醋覫TS2序列進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ITS2序列不僅可以用于植物的DNA條形碼研究，而且對(duì)于動(dòng)物的DNA條形碼研究也具有重要的意義，在中藥材的物種鑒定方面具有潛在的研究?jī)r(jià)值[11-18]。本研究即是利用ITS2序列對(duì)威靈仙基源植物及其多種混偽品進(jìn)行DNA條形碼鑒別研究，為該藥材的準(zhǔn)確鑒定提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料來(lái)源見(jiàn)表1，包括實(shí)驗(yàn)樣品及來(lái)自Genbank下載序列，實(shí)驗(yàn)樣品經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所林余霖副研究員進(jìn)行鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所。

表1 材料來(lái)源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

商品藥材根使用70%乙醇擦洗表面后研磨，取樣約15 mg；植物葉片采用硅膠進(jìn)行干燥，取樣約30 mg，利用植物DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.,China)提取總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序

擴(kuò)增引物正向?yàn)?′-GCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向?yàn)?′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR體系含MgCl22 μl (25 mm)、dNTP 2 μl (2.5 mm)、PCR buffer 2.5 μl(10×)、引物各1.0 μl (2.5 μm)(Sangon Co., China)、聚合酶1.0 U (Biocolor BioScience & Technology Co., China)、總DNA 約1 μl，共為25 μl的反應(yīng)體積。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5分鐘；94 ℃ 30秒，56 ℃ 30秒，72℃ 45秒，40轉(zhuǎn)；72℃ 10分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒(Tiangen Biotech Co., China)回收，純化后作為測(cè)序反應(yīng)的模板，使用ABI 3730XL 測(cè)序儀 (Applied Biosystems Co., USA) 進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

使用CodonCode Aligner 3.71對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行序列拼接，去除引物區(qū)，獲得ITS2 間隔區(qū)序列；使用基于隱馬爾可夫模型的HMMer 注釋方法對(duì)網(wǎng)上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，去除兩端5.8S和26S區(qū)段獲得ITS2間隔區(qū)序列。用MEGA 4.0軟件對(duì)所有序列分析比對(duì)并進(jìn)行種內(nèi)、種間遺傳距離的計(jì)算。計(jì)算基于Kimura 222 Parameter(K2P) 雙參數(shù)模型。用NJ鄰接法(neighbour-2-joining method, NJ)利用比對(duì)過(guò)的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(1000次重復(fù)bootstrap檢驗(yàn)各分支的支持率)，來(lái)直觀(guān)的鑒定各物種。利用Schultz等建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)根據(jù)Schultz等[16]建立的ITS2數(shù)據(jù)庫(kù)及其網(wǎng)站預(yù)測(cè)ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列比較

威靈仙藥材三個(gè)基源植物：毛茛科威靈仙Clematischinensis序列長(zhǎng)度分別為230 bp，含有三個(gè)PolyC和一個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為69.9%；棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮Clematishexapetala序列長(zhǎng)度分別為220 bp含有三個(gè)PolyC和一個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為69.5%；東北鐵線(xiàn)蓮Clematismanshurica序列長(zhǎng)度230 bp，含有三個(gè)PolyC和一個(gè)PolyG結(jié)構(gòu)，GC含量為69.9%。根據(jù)Kimura-2參數(shù)遺傳距離模型計(jì)算得到的序列間遺傳距離，作為藥典收藏威靈仙藥材的三個(gè)基源品種之間的遺傳距離最近，差異最小，威靈仙與棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮，距離值為0.006；威靈仙與東北鐵線(xiàn)蓮，距離值為0.017。金粟蘭科的草珊瑚與威靈仙，棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮和東北鐵線(xiàn)蓮之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，分別為1.083、1.077和1.146。

2.2 種內(nèi)分析

以棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮為例來(lái)分析種內(nèi)變異的情況，將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)結(jié)合從Genbank中下載的兩個(gè)ITS2序列作為3個(gè)種內(nèi)參考序列。比對(duì)后長(zhǎng)度皆230 bp，在151 bp位點(diǎn)的有一個(gè)C-G堿基變異位點(diǎn)。此外，有多個(gè)缺失位點(diǎn)，分別位于1 bp至5 bp、209 bp、222 bp至230 bp位點(diǎn)。種內(nèi)平均K2P變異為0.003，種內(nèi)最大K2P變異為0.005。

2.3 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列種間變異

威靈仙與其主要混偽品ITS2序列間存在較多的變異位點(diǎn)，種間平均K2P距離為0.708。具體種間變異如下圖所示：

(圖1部分，接下頁(yè))

(圖1部分，接上頁(yè))

圖1 威靈仙與其主要混偽品ITS2序列間變異點(diǎn)

2.4 種間聚類(lèi)分析

本研究發(fā)現(xiàn)，ITS2作為DNA條形碼序列，在聚類(lèi)分類(lèi)圖上，威靈仙的三個(gè)基源植物聚在一起，可以有效的鑒別威靈仙基源植物與其易混偽品。鐵線(xiàn)蓮屬的6種植物聚集為一枝，支持率到達(dá)100%，與其他科屬的混偽品，包括草珊瑚、桃兒七、芍藥、毛脈菝葜、土茯苓等植物，都能進(jìn)行很好的區(qū)分，差異非常明顯。而在鐵線(xiàn)蓮屬的6種植物聚集的一枝中，威靈仙藥材正品來(lái)源的3種植物聚集為一枝，支持率到達(dá)83%，結(jié)合枝長(zhǎng)方面的信息，非常易于區(qū)分威靈仙藥材來(lái)源的正品植物和其他同屬的混偽品種。見(jiàn)圖2。

2.5 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

如圖3所示，威靈仙與其3個(gè)混偽品在二級(jí)結(jié)構(gòu)上有明顯差異。重點(diǎn)差異存在于螺旋Ⅳ中。威靈仙二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅳ基部存在2個(gè)小莖環(huán)中間有1個(gè)中頸環(huán)，而毛蕊鐵線(xiàn)蓮和柱果鐵線(xiàn)蓮2個(gè)物種二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋Ⅳ基部的莖環(huán)在大小及位置上均與威靈仙存在明顯區(qū)別。威靈仙二級(jí)結(jié)構(gòu)螺旋I和Ⅲ的莖環(huán)在數(shù)量、大小及位置與芍藥存在明顯不同。因此，ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)也可作為鑒定威靈仙及相近種、偽品的一個(gè)方法。

3 討論

傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法如形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)、超微結(jié)構(gòu)和化學(xué)指紋圖譜等鑒定方法，在中藥材鑒定和評(píng)價(jià)其質(zhì)量研究中發(fā)揮了重要作用。但是，中藥飲片、粉末以及含有生藥原型的傳統(tǒng)中成藥的鑒定非常困難，采用形態(tài)鑒定顯然不可取?；瘜W(xué)分析方法研究的是植物內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物，而次生代謝產(chǎn)物的含量又受生理?xiàng)l件、采收時(shí)間、貯藏等因素的影響，對(duì)于化學(xué)成分相似的物種就更難以區(qū)分因而傳統(tǒng)方法有一定局限性。

ITS2序列長(zhǎng)度較短，易于擴(kuò)增，作為ITS一部分，被廣泛用于系統(tǒng)進(jìn)化研究[7,8]，也是藥用植物DNA柔形碼鑒定最優(yōu)的序列之一，物種水平的鑒定成功率高達(dá)92.7%。在本研究中，ITS2作為DNA柔形碼序列可以有效的鑒別威靈仙與其混偽品。

結(jié)合三種正品威靈仙的產(chǎn)地來(lái)看，威靈仙主要生長(zhǎng)于廣東、云南、四川、陜西、江蘇、安徽等地，棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮主要生長(zhǎng)于江蘇、山東、陜西、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江等地區(qū)，東北鐵線(xiàn)蓮生長(zhǎng)于東北三省，以及朝鮮、俄羅斯等地區(qū)[20]。綜合地區(qū)分別來(lái)看，體現(xiàn)出一種由南向北，分別生長(zhǎng)威靈仙、棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮、東北鐵線(xiàn)蓮的特點(diǎn)，再結(jié)合系統(tǒng)聚類(lèi)樹(shù)中的枝長(zhǎng)信息，在正品威靈仙的單獨(dú)枝內(nèi)部，威靈仙與棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮聚類(lèi)為一枝，支持率為64%，且枝長(zhǎng)上面，棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮更長(zhǎng)，而東北鐵線(xiàn)蓮的枝長(zhǎng)長(zhǎng)于棉團(tuán)鐵線(xiàn)蓮。根據(jù)中性理論與“分子鐘”理論，結(jié)合以上數(shù)據(jù)，說(shuō)明并驗(yàn)證了威靈仙最先起始于南方，再向北發(fā)展的過(guò)程中，為適應(yīng)不同的環(huán)境條件，出現(xiàn)了種間的變異，最終形成了多種威靈仙。資料顯示，鐵線(xiàn)蓮屬的分布中心在中國(guó)的亞熱帶地區(qū)，在中國(guó)范圍內(nèi)云南和四川分布的種類(lèi)最多(包括變種)，然后以此為中心向四周的分布逐漸減少，Helleboroideae起源中心的推測(cè)和鐵線(xiàn)蓮屬古老類(lèi)群的分布，推測(cè)鐵線(xiàn)蓮屬起源于中國(guó)西南地區(qū)。根據(jù)以上分析，本研究結(jié)果驗(yàn)證了這一現(xiàn)象[21]。綜上所述，ITS2作為DNA條形碼序列不僅能夠較好的區(qū)別中藥材威靈仙基源植物與其混偽品，同時(shí)，對(duì)于探討威靈仙屬不同物種間的進(jìn)化關(guān)系亦能起到重要的參考價(jià)值。

圖2 基于ITS2序列構(gòu)建的威靈仙及其混偽品的鄰接(NJ)樹(shù)(bootstrap1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率≥50%)

圖3 威靈仙及其主要易混偽品ITS2序列二級(jí)結(jié)構(gòu)

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