韋袞政 和菊花 劉濤 錢銳 張馨予 儲麗英 祁向榮

肺脹是中醫(yī)學對多種肺系疾病所致肺氣脹滿、不能斂降的一類疾病的總稱，相當于現代醫(yī)學的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)。既往的動物實驗可以形成慢性支氣管炎、肺氣腫、肺心病、心衰各階段動物模型。本病證的特點是氣道有慢性炎癥改變、肺氣腫和右心衰同時存在。以往的造模處理因素比較單一，與本病證復雜的臨床病理實際差距較大，擬建立造模因素與臨床病理因素相類似、病理改變與臨床特征更相符的病證模型，形成慢性氣道炎癥、肺氣腫和右心衰的統一體，形成肺脹陽虛和水泛的統一體。本實驗從肺脹的病機出發(fā)，借鑒以往的造模經驗，建立肺脹陽虛水泛證動物模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物：SD大鼠，雌雄各半，體重200～250 g，許可證號：SCXK(滇)2005-0008，由昆明醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)，Sigma公司產品，型號L2880，規(guī)格10 mg，批號055∶B5。野百合堿(Crotaline)，Sigma公司產品，型號C2401，規(guī)格500 MG，批號119K1579。氫化可的松，天津金耀氨基酸有限公司產品，國藥準字H12020886，規(guī)格25 mg/5 ml。阿霉素(鹽酸多柔比星)，浙江海正藥業(yè)股份有限公司產品，國藥準字H33021980，批號100301，規(guī)格10 mg/瓶。芙蓉牌過濾嘴香煙，湖南中煙工業(yè)有限責任公司出品，焦油量：12 mg/支。西門子超聲心動圖儀型號SEQUOIA512，探頭型號15L8W-S。自制雙層鐵架80 cm×50 cm×50 cm，外套可上下移動的透明薄膜，頂膜開通直徑1.5 cm通氣圓孔6個。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組：選取健康合格實驗動物SD大鼠64只，隨機分為空白對照組10只；氫化可的松對照組12只；阿霉素對照組12只；阿霉素低劑量組15只；阿霉素高劑量組15只。造模過程是連續(xù)的，大體上分為4個階段。

1.3.2 建立慢性支氣管炎、肺氣腫模型階段：氫化可的松對照組、阿霉素對照組、阿霉素低劑量組分別于實驗第1、21天氣管內每次注入LPS各0.2 mg(0.1 ml)；阿霉素高劑量組分別于實驗第1、21、51天氣管內每次注入LPS各0.2 mg(0.1 ml)，空白對照組分別于實驗第1、21天氣管內注入生理鹽水0.1 ml/次。氣管內注入脂多糖方法：1%苯巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射，麻醉后，暴露喉頭，以靜脈套管針替代氣管導管行氣管插管，向大鼠氣管內注入LPS 0.2 mg，完畢后將大鼠垂直旋轉10～20秒，使LPS均勻分布于肺部。自實驗開始的90天內，除氣管內注入藥物、肌肉注射或腹腔注射藥物的當天外，其余時間均將大鼠置于密閉透明塑料薄膜箱內，箱下小鐵架上點燃香煙，拉下塑料薄膜罩住煙霧，香煙用量30支/(m3·15min)，每次連續(xù)30分鐘，每天1次?？瞻讓φ战M置正?？諝庵泻粑?。

1.3.3 建立肺動脈高壓模型階段：實驗第61天造模大鼠腹腔內一次性注射2%野百合堿溶液，氫化可的松對照組、阿霉素對照組、阿霉素低劑量組60 mg/kg，阿霉素高劑量組70 mg/kg?？瞻讓φ战M一次性腹腔注射生理鹽水2 ml。

1.3.4 建立陽虛模型階段：實驗第63天起造模大鼠臀部肌肉注射0.5%注射氫化可的松，阿霉素對照組、阿霉素低劑量組每次20 mg/kg，阿霉素高劑量組每次30 mg/kg，每天下午1次，連續(xù)7天?？瞻讓φ战M、氫化可的松對照組大鼠臀部肌肉注射生理鹽水1 ml。

1.3.5 建立右心衰模型階段：實驗第71天開始造模大鼠腹腔注射1‰阿霉素每次2 mg/kg，每周1次，低劑量組共6次，累計用量為12 mg/kg，高劑量組共8次，累計用量16 mg/kg?？瞻讓φ战M、阿霉素對照組每次腹腔注射生理鹽水2 ml，每周1次，共6次。

1.4 一般觀察

觀測大鼠的一般情況：心率、呼吸狀態(tài)、體重、飲食、精神、活動動作、姿態(tài)、毛發(fā)、鼻色、眼瞼、喘鳴、咳嗽、皮膚、下肢、爪、大便、小便等。

1.5 檢測項目

1.5.1 心臟超聲心動圖檢測

各組于煙熏前、氫化可的松肌肉注射結束后第1天、阿霉素腹腔注射結束后第7天(阿霉素對照組同阿霉素低劑量組、空白對照組同阿霉素高劑量組)，分別行心臟超聲心動圖檢查。先行1%苯巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射，麻醉后胸腹區(qū)備皮，仰臥位固定，采用超聲心動圖儀，14 MHz高頻探頭，標準胸骨旁左室長軸、短軸、心尖四腔切面，測量左心室舒張末期內徑(LV-Diastole)、左心室收縮末期內徑(LV-Systole)、射血分數(LVEF)。

1.5.2 測量尿量

各組于煙熏前、氫化可的松肌肉注射結束后第2、3天、阿霉素腹腔注射結束后第8、9天(阿霉素對照組同阿霉素低劑量組、空白對照組同阿霉素高劑量組)，分別收集大鼠自由飲水情況下和禁水情況下24小時尿量。

1.5.3 探查內臟

實驗結束時，頸椎旋轉法處死大鼠，切開胸腹腔，觀察心包、心臟、肺臟、胸水、腹水情況，從環(huán)狀軟骨上緣切斷氣管，修去脂肪，取出心和肺，沿心臟外緣剪去大血管，濾紙吸去血液，觀察肺臟、心臟、心包表面情況，稱量心、肺重量(包括氣管)，計算肺臟與體重、心臟與體重的比值。

1.6 統計方法

2 結果

2.1 癥狀

動物一般情況：煙熏開始時大鼠憋氣、咳嗽、亂竄，尋找地方躲藏，10分鐘后開始汗出、流涕，乏力，繼而靜止不動，停止煙熏、正常空氣呼吸后開始活躍。氣管內注入脂多糖后1小時內，大鼠出現嚴重刺激性咳嗽、呼吸困難。煙熏30天后大鼠精神欠佳，活動減少，時有咳嗽，毛發(fā)煙黃色。2個月后出現偶有喉間哮鳴音，呼吸急促，消瘦。肌肉注射氫化可的松后第2天即出現畏寒、弓背、縮身、體毛枯疏蓬松等肺陽虛表現。注射阿霉素后期大鼠精神極度萎靡，行動遲緩，咳嗽加重，呼吸急促，畏寒，弓背、縮身，體毛枯疏蓬松無光澤，瞇眼，極度消瘦，納食減少，尿量減少等衰竭表現。阿霉素高劑量組衰竭表現較重，阿霉素對照組無衰竭表現。氫化可的松對照組無陽虛表現。空白對照組則活潑好動，體肥，皮毛亮澤緊密色白，無明顯咳嗽、氣促、納差、尿少等表現。

2.2 尿量變化

從預實驗的觀察中得知，在自由飲水情況下，部分大鼠的尿量過多，組內差別相當大，與飲水量明顯相關，而在禁水情況下，組內懸殊明顯縮小。末次大鼠正常飲水和禁水情況下24小時平均尿量見表1。

末次大鼠24小時尿量在自由飲水情況下，阿霉素高劑量組、阿霉素低劑量組與空白對照組相比有顯著性差異；在禁水情況下，阿霉素高劑量組與空白對照組相比有顯著性差異。

表1 末次大鼠24小時尿量

2.3 超聲心動圖檢查結果

氫化可的松階段大鼠心臟擴大不顯著，阿霉素注射后大鼠心肌肥厚、心臟擴大、心功能下降，高劑量組更為顯著。各組左心室舒張末期內徑、收縮末期內徑及射血分數超聲心動圖檢測結果見表2-3。

末次阿霉素對照組、氫化可的松對照組大鼠左心室舒張末期內經、左心室收縮末期內經、射血分數與空白對照組相比無顯著性差異。末次阿霉素高劑量組、阿霉素低劑量組大鼠左心室舒張末期內經、射血分數與空白對照組相比有顯著性差異，末次阿霉素高劑量組大鼠左心室收縮末期內經與空白對照組相比有顯著性差異，末次阿霉素高劑量組大鼠射血分數與阿霉素低劑量組相比有顯著性差異。

表2 末次大鼠心臟超聲檢測結果

表3 實驗前后各組大鼠心臟超聲檢測結果

氫化可的松對照組大鼠左心室舒張末期內經前后相比有顯著性差異。阿霉素對照組、阿霉素低劑量組、阿霉素高劑量組大鼠左心室舒張末期內徑、左心室收縮末期內徑、射血分數實驗前后相比有顯著性差異。

2.4 腹腔臟器表現

成模后部分大鼠出現心包積液、胸腔積液、腹腔積液，腹腔積液量多達8 ml，以阿霉素高劑量組為多見。部分大鼠出現肺臟瘀血斑點，少數出現心臟瘀血斑點，空白對照組無內腔積液、瘀血表現。肺臟與體重、心臟與體重的比值相比無顯著性差異。見表4。

表4 大鼠肺臟重量、心臟重量與體重的比值

2.5 成模率

預實驗時，大鼠高劑量(每次50 mg/kg)氫化可的松肌肉注射后立即死亡的1只，第2天死亡2只，正式實驗時減少氫化可的松劑量。隨著阿霉素劑量的增加，死亡率相對增高。本實驗總死亡率在20%左右。經過香煙反復熏吸、氣管內注入脂多糖后大鼠肺脾氣虛證的成模率達90%以上，氫化可的松肌肉注射后陽虛證成模率達100%，按形成心包積液、胸腔積液、腹腔積液計算，阿霉素高劑量組陽虛水泛證成模率達40%。

3 討論

肺脹是中醫(yī)病名，在《靈樞經·脹論》中已有記載，“肺脹者，虛滿而喘咳”[1]。肺脹陽虛水泛證是肺脹的一個證型，漢代《金匱要略·水氣病脈證并治》云：“咳而喘，不渴者，此為肺脹，其狀如腫[2]”，嚴重時可出現“咳逆倚息，短氣不得臥，其形如腫”的癥狀，這就是肺脹陽虛水泛證。COPD以氣流受限不完全可逆為特征，以肺功能檢查為指標，臨床上以咳、痰、喘為表現。肺脹同樣以咳、痰、喘、甚則腫為主要表現，肺脹與COPD 不完全相等，但大部分重疊。從癥狀上看，肺脹陽虛水泛證與COPDⅣ期(極重度)伴右心衰癥狀相似。右心衰的水泛屬陰水性質，右心衰的本質屬陽虛范疇，與腎、脾、心陽虛有關。

COPD是多因素誘發(fā)的一種疾病，病情的發(fā)展多數經歷了慢性支氣管炎、肺氣腫、肺動脈高壓、肺心病、心衰的過程。許多學者模擬COPD的病理變化和臨床特征，對動物模型進行了多項研究。如利用煙熏法建立肺氣腫動物模型[3]。采用煙熏40天加氣管內注入脂多糖(LPS)的方法可以成功制備COPD模型[4]。野百合堿可引起肺血管內皮細胞損傷、肺血管重建，導致肺心病肺動脈高壓[5,6]。在研究陽虛的模型中，以皮質激素模型為最多、最可靠[7]。應用阿霉素腹腔注射，累計劑量24 mg/kg，6周后可形成心衰模型[8]。

本實驗基于重癥COPD的病理過程，應用多種致病因素，復合造模。通過序貫應用香煙反復熏吸、氣管內注入脂多糖、野百合堿腹腔注射、氫化可的松肌肉注射及阿霉素腹腔注射，可以引起大鼠心臟擴大、心肌肥厚、左心室舒張期末內徑增大、左心室收縮期末內徑增大、左心室射血分數下降，嚴重時形成心包積液、胸腔積液、腹腔積液改變。從表現來看，形成了肺脹陽虛水泛證動物模型。肺脹陽虛水泛證動物模型的形成是多種因素的累積效應，香煙反復熏吸、氣管內注入脂多糖、野百合堿腹腔注射可形成肺脹肺脾氣虛型動物模型；在此基礎上，應用氫化可的松肌肉注射，可以形成肺脹陽虛證；繼續(xù)應用阿霉素腹腔注射，可以形成肺脹陽虛水泛證，與臨床常見的重癥慢性阻塞性肺疾病表現相類似。快速出現陽虛癥狀的因素是氫化可的松，引起陽虛水泛的關鍵因素應是阿霉素，因單用野百合堿腹腔注射未見到水泛現象，如果是重疊效應，仍以阿霉素高劑量組多見。在人體，水泛多表現在下肢部位，顯而易見。而在爬行動物，四肢肌肉血管較少，下肢水液墜積不顯著，較難形成下肢水腫現象，水液容易積聚在胸腹部。實驗中氫化可的松肌肉注射后大鼠較快死亡的原因有待進一步探討。通過形態(tài)觀察、腹腔探查、心臟超聲心動圖檢查等，可以認為該實驗形成了肺脹陽虛水泛證動物模型。該模型煙熏時間長，心功能下降顯著，是一種有效的肺脹陽虛水泛證動物模型造模方法。

[1] 田代華，劉更生整理.靈樞經[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:80.

[2] 漢·張仲景撰.金匱要略[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:53.

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[4] 宋一平，崔德健，茅培英，等.慢性阻塞性肺疾病大鼠模型的建立及藥物干預的影響LJ].中華內科雜志,2000,39(8):556-557.

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[6] 張國偉，于洋，祁家駒.野百合堿注射復制大鼠右心衰竭模型[J].心肺血管病雜志,2009,28(6)：423-426.

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[8] 李梅秀，田國忠，歐葉濤，等.大鼠阿霉素慢性心衰模型的制備與心衰指標的判定[J].解剖學研究,2005,17(3):176.