王 勇，王思軒，李 春，啜文靜，郭淑貞，趙慧輝，陳建新，余俊達(dá)，王 偉

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理室，北京 100029)

本實(shí)驗(yàn)通過冠狀動脈環(huán)縮術(shù)建立慢性心肌缺血模型，動態(tài)全面地觀察各組動物心肌缺血后Cyto C、SOD、MDA、NO及 TNF-α 的變化，探討冠心病慢性心肌缺血血瘀證起病發(fā)病的早期病理機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎癥、內(nèi)皮障礙的關(guān)系。

1 材料

1.1 動物與分組

動物為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)育種健康雄性中華小型豬，體重26 kg±5 kg，月齡6～10個(gè)月，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組2組，動物各12只。

1.2 材料、試劑與儀器

內(nèi)徑2.75mm的Ameroid縮窄環(huán)(Research Instrument SW，USA);安爾碘(上海利康消毒高科技有限公司，批號20050808);鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號KH050302);Cyto C、SOD、MDA、NO 及 TNF-α 試劑盒(北京華英生物技術(shù)研究所)。

2 方法

2.1 中華小型豬冠心病(心肌缺血)模型的建立及證候評價(jià)

動物麻醉后輔助呼吸，暴露左冠狀動脈前降支，兩線平移牽引法在第一對角支遠(yuǎn)端的前降支主干上放置Ameroid縮窄環(huán)，建立慢性心肌缺血模型[5]。術(shù)后0～8周對動物進(jìn)行全面觀察，采集包括舌象在內(nèi)的詳細(xì)四診信息，并通過心電圖、冠脈造影等輔助手段進(jìn)行評價(jià)。根據(jù)1986年中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會活血化瘀專業(yè)委員會制訂的血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)，明確術(shù)后4周動物表現(xiàn)為穩(wěn)定的冠心病(心肌缺血)血瘀證的時(shí)間點(diǎn)，并在術(shù)后4～8周血瘀證表現(xiàn)呈穩(wěn)定狀態(tài)[1]。

2.2 SOD、MDA、Cyto C、TNF-α 和 NO 的測定

小型豬術(shù)前、術(shù)后4、8周，行冠狀動脈造影和心功能檢查后，分別在頸部前腔靜脈采血5mL，肝素抗凝(抗凝劑:100μL/5mL全血)，血漿用于檢測SOD、MDA、Cyto C、TNF-α 和 NO 水平。樣品在室溫復(fù)溶后，采用ELISA法檢測。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示。組間比較采用成組t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。相關(guān)分析采用Pearson法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般資料

手術(shù)4周后，假手術(shù)組動物精神逐漸恢復(fù)正常;采進(jìn)、飲水量增加，被毛整齊，有光澤。模型動物易激惹，不易接近，抓取時(shí)反抗劇烈，叫聲高亢、持續(xù)時(shí)間長，沖撞籠欄，被毛疏松雜亂豎立、無光澤，鼻盤干燥少津，舌質(zhì)紫暗，前后蹄出現(xiàn)肌膚甲錯(cuò)等血瘀證候體征。

3.2 病理觀察結(jié)果

圖1顯示，大體病理觀察左室腔擴(kuò)大，左室前壁變薄的改變與超聲心動的結(jié)果一致。病理切片HE染色提示，膠原纖維增生、心肌細(xì)胞變性、壞死、炎性細(xì)胞侵潤等病理改變與心肌缺血的診斷吻合。

圖1 模型與假手術(shù)術(shù)后4周心肌組織HE病理切片變化(HE×400)

3.3 4周后舌色變化

表1圖2顯示，采用 Photoshop7.0對數(shù)碼相機(jī)拍攝的舌質(zhì)圖片進(jìn)行分析，R、G、B比的分析結(jié)果顯示，與同期假手術(shù)組動物相比，模型組動物術(shù)后4～8周R比顯著降低(P<0.05)，G比、B比顯著升高(P<0.05)，提示動物舌色從紅到青紫的演變與肉眼觀察結(jié)果一致。

3.4 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化

表1 0～8周模型組舌尖r、g、b值(s)

表1 0～8周模型組舌尖r、g、b值(s)

注:與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較:▲P<0.05

周數(shù) 組 別 n r G b 4周 假手術(shù)組12 0.47±0.110 0.26±0.041 0.25±0.076模 型 組 12 0.38±0.032▲0.30±0.01▲ 0.32±0.018▲0.30±0.015 8周 假手術(shù)組 12 0.43±0.043 0.28±0.024 0.29±0.028模 型 組 12 0.39±0.016▲ 0.31±0.017▲

圖2 假手術(shù)與模型組動物術(shù)后4周舌色改變

表2顯示，與同期假手術(shù)組動物比較，模型組動物抗氧化酶活性下降，表現(xiàn)為 SOD升高16.94%，MDA升高20.32%，差異顯著(P<0.05)，并發(fā)現(xiàn)作為呼吸鏈上的重要節(jié)點(diǎn)分子的Cyto C發(fā)生了顯著改變，升高了 50.79%。術(shù)后 4周和 8周模型組TNF-α、NO濃度與同期假手術(shù)組動物相比差異顯著(P<0.05)。

3.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)與 TNF-α、NO之間的相關(guān)性分析

將 SOD/MDA、Cyto C的濃度與 TNF-α、NO濃度分別進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，炎癥反應(yīng)的特征分子TNF-α濃度與Cyto C呈顯著正相關(guān)(y=12.804x－12.411，R2=0.9031)，與 SOD/MDA 呈顯著負(fù)相關(guān)(y= －11.702x+38.051，R2=0.992)，而作為反映內(nèi)皮功能重要指標(biāo)的NO與Cyto C呈負(fù)相關(guān)(y=－0.1732x+17.319，R2=0.99)，與 SOD/MDA 呈正相關(guān)(y=0.1386x+11.972，R2=0.8403)。

表2 術(shù)后4～8周機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(s)

表2 術(shù)后4～8周機(jī)體氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化(s)

注:與假手術(shù)組比較:▲P<0.05

組別n Cyto C(ng/ml)SOD(pg/ml)MDA(ng/ml)NO(pg/ml)TNF-α(ng/ml)假手術(shù)組4周 12 5.67±1.530 103.24±5.348 5.12±0.907 63.47±7.060 1.22±0.760假手術(shù)組8周 12 5.20±1.457 100.59±11.146 5.41±0.356 66.03±4.324 1.24±0.338模 型 組4周 12 8.55±1.329▲ 85.75±18.029▲ 5.75±0.910▲ 50.57±6.334▲ 1.67±0.458▲模 型 組8周 12 8.77±2.529▲ 88.97±16.084▲ 5.91±0.697 49.39±7.038▲ 1.61±0.432▲

4 討論

血瘀證是中醫(yī)臨床常見證型，已成為中西醫(yī)結(jié)合學(xué)術(shù)研究最受國內(nèi)外關(guān)注的領(lǐng)域之一[2]?；A(chǔ)研究主要集中在血瘀證與炎癥、內(nèi)皮功能障礙等方面。其中炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮功能障礙引起相關(guān)分子的失衡被認(rèn)為是血瘀證重要的生物學(xué)基礎(chǔ)，TNF-α與NO作為炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮功能障礙的特異性分子得到了深入的研究。本課題組前期通過數(shù)據(jù)挖掘的方法提起TNF-α與NO的特征模式診斷血瘀證有很高的準(zhǔn)確性，氧化應(yīng)激作為誘導(dǎo)心血管功能異常的病理機(jī)制，與炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮障礙關(guān)系密切，可啟動炎癥或加重炎癥反應(yīng)，惡化內(nèi)皮功能，從而成為血瘀證可能的生物學(xué)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過對冠心病慢性心肌缺血血瘀證模型的動態(tài)觀察，對氧化應(yīng)激在血瘀證早期可能扮演的角色及其與炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙之間的關(guān)系進(jìn)行探討，以期發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在血瘀證病理機(jī)制中的作用，為血瘀證診斷特征模式的完善提供新的參考指標(biāo)。

在正常情況下，機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的活性氧簇(ROS)的速度與清除速度保持平衡，血管最主要的ROS是超氧陰離子(·O－2)，而抗氧化方面SOD可以歧化·O－2生成H2O。但是當(dāng)產(chǎn)生的活性氧簇超出抗氧化劑清除能力的時(shí)候，就會導(dǎo)致其生物利用度增加，·O－2和NO的反應(yīng)產(chǎn)物過氧化亞硝酸鹽是強(qiáng)氧化劑分子，使血管舒張因子NO失活，內(nèi)皮源性NO減少，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，血管收縮性增強(qiáng)，單核細(xì)胞浸潤及炎癥[3、4]。由于·O－2半衰期相當(dāng)短，通常以易于測量的氧化產(chǎn)物 MDA來反映ROS的含量[9]，作為機(jī)體氧化應(yīng)激程度的評估。

本研究證實(shí)，術(shù)后4周模型動物舌色從紅到青紫演變，血液流變學(xué)異常，并結(jié)合動物宏觀體征與行為學(xué)判別為血瘀證[5]，而 SOD、MDA、Cyto C 也與血瘀證形成的初期發(fā)生了顯著的變化，提示血瘀證初期機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激反應(yīng)在早期即參與了血瘀證的啟動與形成[6]。而 Cyto C作為呼吸鏈上的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)分子出現(xiàn)較早，持續(xù)時(shí)間長(至8周)，升高幅度最大，達(dá)到50.79%，且與 SOD、MDA呈線性關(guān)系，敏感性較高，故可選為反應(yīng)氧化應(yīng)激損傷程度較為理想的觀測指標(biāo)。

此外實(shí)驗(yàn)顯示，在冠心病心肌缺血血瘀證病證結(jié)合動物模型造模成功后，機(jī)體同時(shí)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)與內(nèi)皮功能障礙，并與氧化應(yīng)激損傷程度高度相關(guān)。炎癥標(biāo)志物TNF-α濃度與Cyto C呈強(qiáng)烈正相關(guān)，與SOD/MDA呈強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)，而作為反映內(nèi)皮功能重要指標(biāo)的 NO與Cyto C呈負(fù)相關(guān)，與 SOD/MDA呈正相關(guān)，說明氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)彼此間相互協(xié)調(diào)、相互促進(jìn)，共同作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞和其他病理環(huán)節(jié)，加重內(nèi)皮功能的惡化，加劇血瘀證的臨床表現(xiàn)?？梢?，在血瘀證的形成與發(fā)展過程中，氧化應(yīng)激損傷反應(yīng)與炎癥反應(yīng)、內(nèi)皮功能障礙相互作用，互為因果，形成了血瘀證早期可能的內(nèi)在病理機(jī)制，三者之間消長平衡決定了血瘀證可能的證候演變與轉(zhuǎn)化。通過早期干預(yù)氧化應(yīng)激相應(yīng)的環(huán)節(jié)，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的程度，可有效地保護(hù)血管內(nèi)皮功能，降低炎癥反應(yīng)的水平，改善血瘀證的臨床癥狀，為臨床冠心病血瘀證的治療提供新的干預(yù)環(huán)節(jié)。

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