張旭 滕大才 徐鐵軍 高偉

迄今為止，國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)NMDA受體在腦缺血中介導(dǎo)的興奮毒作用的危害，興奮毒性可導(dǎo)致急性細(xì)胞死亡(壞死)，也可激起延遲類型的細(xì)胞死亡 (凋亡)［1－3］?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)NMDAR至少存在7個(gè)亞單位［4，5］。其中，NR1亞單位是必需亞單位，2A和2B是主要的調(diào)節(jié)亞單位。因此把在缺血中起正性作用的亞單位作為靶目標(biāo)，發(fā)展針對(duì)缺血性腦血管病的理想藥物，而不干擾這些通道的正常生理功能，是目前和未來(lái)發(fā)展的趨勢(shì)［6］。本研究針對(duì)缺血后大鼠海馬NR2A mRNA的表達(dá)及蛋白變化情況，探討其可能存在的關(guān)系，為進(jìn)一步研究缺血性腦損傷的分子機(jī)制及研制和開發(fā)針對(duì)NR2A亞單位的特異性新藥提供理論基礎(chǔ)和形態(tài)學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 寡核苷酸探針雜交試劑盒(博士德生物工程有限公司);2A免疫組化一抗(Santa Cruze)，DEPC和DAB(Sigma)公司;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雄性SD大鼠30只，體重250～300 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 動(dòng)物分組及模型制作 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(NC組，n=6)、假手術(shù)對(duì)照組(SC組，n=12)、缺血再灌組(IR組，n=12)。采用改良的四動(dòng)脈阻斷法(4 AO)建立短暫性前腦缺血(15 min)再灌注動(dòng)物模型［7］，再灌時(shí)間為24 h和48 h。在確定的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行灌注固定，滿足以下條件的大鼠進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn):(1)第1次手術(shù)后24 h動(dòng)物清醒;(2)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈后大鼠應(yīng):①掙扎＜50 s;②翻正反射消失;③呼吸頻率先快速上升，后下降并穩(wěn)定在正常范圍;④雙側(cè)瞳孔由小變大，由紅變白;⑤角膜反射消失。SC組大鼠除不電凝椎動(dòng)脈和不夾閉頸總動(dòng)脈外，其他手術(shù)過(guò)程同IR組。

1.3 灌注固定及切片制備 IR組在復(fù)灌后24和48 h與對(duì)應(yīng)的NC組和IR組大鼠用20%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉，經(jīng)心-升主動(dòng)脈插管灌注固定。在立體定位儀上將鼠腦冠狀位分為前、中、后3段，取包含海馬的中段入0.1 mol/L PBS(4℃，過(guò)夜)、入70%乙醇(4℃，過(guò)夜)。脫水:80%乙醇(1 h)，95%乙醇(1 h×2)，100%乙醇(1 h×2)，透明:二甲苯(0.5 h×2);浸蠟:62℃(1 h×2);石蠟包埋。將包埋的腦塊作連續(xù)冠狀切片，片厚8 μm，以45℃展片，70℃烤片3 h。切片分8套，分別進(jìn)行焦油紫染色、NR2A原位雜交和免疫組化染色，TUNEL染色及陰性對(duì)照染色。

1.4 IHC和ISH反應(yīng) IHC按ABC試劑盒說(shuō)明書和本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行［7］。ISH反應(yīng)按試劑盒說(shuō)明書和本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行［8］。

1.5 圖像分析 原位雜交和免疫組化的切片用LE2ICA QWin圖像分析儀對(duì)CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞和齒狀回顆粒細(xì)胞的染色強(qiáng)度進(jìn)行灰度測(cè)量，以相應(yīng)背景灰度值減去各測(cè)量點(diǎn)灰度值后的平均值作為海馬各區(qū)的最終灰度值;TUNEL染色的切片在光鏡下計(jì)數(shù)CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)，求出凋亡細(xì)胞百分率。

2 結(jié)果

2.1 IR組24 h，焦油紫染色結(jié)果顯示CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量均無(wú)明顯變化;CA3區(qū)和齒狀回的細(xì)胞未見明顯改變。缺血后48 h，CA1區(qū)細(xì)胞胞體開始縮小，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，細(xì)胞淡染，并出現(xiàn)了壞死細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞固縮，并有破裂。CA3區(qū)可見少量的細(xì)胞胞體縮小，齒狀回細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量未見明顯改變。見圖1、2。

圖1 假手術(shù)組(焦油紫×40)

圖2 缺血48 h(焦油紫×40)

2.2 在CA1區(qū)，NR2A mRNA的表達(dá)于IR組24 h升至SC組的141.5%(P＜0.01)。IR組24 h在CA3區(qū)和齒狀回，缺血后NR2A mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。見表1，圖3、4。

表1 3組大鼠海馬CA1區(qū)NR2A原位雜交強(qiáng)度比較

表1 3組大鼠海馬CA1區(qū)NR2A原位雜交強(qiáng)度比較

注:與IR組比較，*P＜0.01

25.6±2.5 24.3±3.2 SC 組(n=12) 27.5±1.2* 23.9±2.8 26.4±3.5 IR組(n=12)CA1 CA3 DG NC 組(n=6) 26.3±3.6*組別38.9±2.4 26.5±3.1 27.1±2.6

2.3 在CA1區(qū)，NR2Am RNA的表達(dá)于IR組48 h降至SC組的59.3%(P＜0.01)。IR組48 h在CA3區(qū)和齒狀回缺血后NR2A mRNA的表達(dá)無(wú)明顯變化。見表2，圖5、6。

圖3 假手術(shù)組(原位雜交×40)

圖4 缺血24 h(原位雜交×40)

表2 3組大鼠海馬CA1區(qū)NR2A免疫組化強(qiáng)度比較

表2 3組大鼠海馬CA1區(qū)NR2A免疫組化強(qiáng)度比較

注:與IR組比較，*P＜0.01

CA1 CA3 DG NC 組(n=6) 39.4±3.4*組別37.3±3.2 38.5±2.3 SC 組(n=12) 35.9±2.1* 36.9±2.8 37.8± 3.1 IR組(n=12)21.3±2.2 35.2±3.1 35.6±2.4

圖5 假手術(shù)組(免疫組化×40)

圖6 缺血48 h(免疫組化×40)

2.4 TUNEL染色顯示IR組24 h海馬CA1區(qū)出現(xiàn)了凋亡陽(yáng)性細(xì)胞，而CA3和齒狀回卻沒(méi)有出現(xiàn)。IR組48 h細(xì)胞凋亡為42.1±2.8，復(fù)灌24 h 為 35.2±3.0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，而CA3和齒狀回卻沒(méi)有出現(xiàn)。見圖7、8。

圖7 缺血24 h(TUNEL×40)

圖8 缺血48 h(TUNEL×40)

3 討論

本課題組既往實(shí)驗(yàn)表明，在腦缺血復(fù)灌后24、48、72 h，在海馬CA1區(qū)NR2A mRNA水平升高［8］，而NR2A蛋白水平降低［7］，但在復(fù)灌后6 h～7 d的其他時(shí)間點(diǎn)，兩者都呈現(xiàn)一致變化，既都是表達(dá)降低［7，8］，為證明此3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的不一致是由不同實(shí)驗(yàn)者、不同批動(dòng)物所導(dǎo)致還是由于腦缺血早期時(shí)2A亞單位確實(shí)存在不一致變化這一現(xiàn)象，本實(shí)驗(yàn)研究了同一批大鼠在在腦缺血復(fù)灌后24和48 h的mRNA和蛋白的變化情況，以期揭示這一現(xiàn)象的原因所在。

目前已有實(shí)驗(yàn)報(bào)道在腦缺血中存在mRNA和蛋白不一致變化的現(xiàn)象，這一現(xiàn)象歸因于在腦缺血時(shí)，蛋白的合成，而非轉(zhuǎn)錄，經(jīng)常減弱，盡管mRNA的表達(dá)總的認(rèn)為反映了蛋白水平的變化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在腦缺血早期NR2A mRNA水平和蛋白水平確實(shí)存在著不一致變化。而這一現(xiàn)象在形態(tài)學(xué)方面并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。

研究表明腦部是唯一依靠氧化磷酸化來(lái)產(chǎn)生能量代謝的。全腦缺血導(dǎo)致細(xì)胞功能所受影響之一就是蛋白質(zhì)的合成。在嚙齒類，在腦血流只有正常的70% ～80%時(shí)，腦蛋白質(zhì)的合成是下調(diào)的。這一數(shù)值超過(guò)了維持ATP生產(chǎn)的灌注率。這一結(jié)果表明并非只有能量因素參與了翻譯的下調(diào)過(guò)程。在復(fù)灌中，蛋白的合成被強(qiáng)烈抑制，它的恢復(fù)也比能量代謝的恢復(fù)慢的多。有趣的是，在易損性的神經(jīng)元壞死之前，觀察到持續(xù)的翻譯抑制［9］。在易損性神經(jīng)元中阻止翻譯的恢復(fù)這一確切的機(jī)制尚不明確，但在翻譯的下調(diào)和神經(jīng)元的易損性之間這一驚人的聯(lián)系中，表明前者在導(dǎo)致缺血細(xì)胞死亡這一發(fā)病機(jī)制的級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起了關(guān)鍵性的作用［9，10］。因此本實(shí)驗(yàn)表明NR2A亞單位在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡中起了重要作用。

多項(xiàng)研究已經(jīng)證明了這一結(jié)論即mRNA的水平并不絕對(duì)預(yù)示著相應(yīng)的蛋白水平［11］。腦缺血中，翻譯和轉(zhuǎn)錄并不相伴這一現(xiàn)象不僅是時(shí)間依賴性的，而且在全腦缺血中，很可能是細(xì)胞特異性的［12］。因此，在確定一個(gè)特殊的蛋白是否在腦缺血過(guò)程中起了重要作用，證實(shí)蛋白的表達(dá)和/或蛋白的功能絕對(duì)必要的。因而，它為未來(lái)研究神經(jīng)保護(hù)這一治療目標(biāo)提供了一個(gè)方向。

被缺血誘導(dǎo)的翻譯抑制在抵抗區(qū)在最初的12～24 h即恢復(fù)，而在易損區(qū)則持續(xù)收到抑制［13］。本研究發(fā)現(xiàn)相對(duì)于CA3區(qū)和齒狀回，海馬CA1區(qū)在24 h即出現(xiàn)了凋亡細(xì)胞，在48 h出現(xiàn)了細(xì)胞壞死。這與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的再灌注的2～3 d到第7天遲發(fā)性神經(jīng)元壞死這一過(guò)程即開始了相一致［14］。而在缺血后早期2A亞單位的mRNA和蛋白水平既發(fā)生了變化，蛋白降低，下調(diào)的此蛋白很可能導(dǎo)致了CA1區(qū)神經(jīng)元的功能喪失。因此，這一變化也許參與導(dǎo)致了CA1區(qū)在腦缺血中的易損性這一現(xiàn)象和腦缺血的壞死、凋亡過(guò)程，表明它在未來(lái)的研究中更具有潛在的價(jià)值。結(jié)合本課題組其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在缺血再灌注24 h前，NMDA受體2A亞單位的mRNA和蛋白水平是呈現(xiàn)一致變化的［7，8］。另有實(shí)驗(yàn)證明，缺血再灌注24 h時(shí)，海馬區(qū)神經(jīng)元受到的損傷是可逆的，功能狀態(tài)受到抑制，在某些條件下如強(qiáng)刺激可被重新激活?？梢酝茰y(cè)，這時(shí)神經(jīng)元的生存可通過(guò)某些條件挽救。這與缺血早期，某些因素的干預(yù)可扭轉(zhuǎn)凋亡方向，阻止細(xì)胞的凋亡是一致的［15］。因此，把2A亞單位作為耙目標(biāo)，觀察阻斷2A亞單位后缺血性腦損傷的變化，也許能揭示2A亞單位在腦缺血中的作用。

1 Zhang FX，Rubin R，Rooney TA.N-Methyl-D-aspartate inhibits apoptosis through activation of phosphatidylinositol 3-kinase in cerebellar granule neurons.A role for insulin receptor substrate-1 in the neurotrophic actionof N-methyl-Daspartate and its inhibition by ethanol.J Biol Chem，1998，273:26596-26602.

2 Bonfoco E，Krainc D，Ankarcrona M，et al.Apoptosis and necrosis:two distinct events induced，respectively，by mild and intense insults with N-methyl-D-aspartate or nitric oxide/superoxide in cortical cell cultures.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:7162-7166.

3 A Villringer，U Dirnagl.Pathophysiology of cerebral ischemia.Z Arztl Fortbild Qualitatssich，1999，93:164-168.

4 Goebel DJ，Poosch MS.NMDA receptor subunit gene expression in the rat brain:a quantitative analysis of endogenous mRNA levels of NR1，NR2A，NR2B，NR2C，NR2D and NR3A.Brain Res Mol Brain Res，1999，69:164-170.

5 Wenzel A，Scheurer L，Kunzi R，et al.Distribution of NMDA receptor subunit proteins NR2A，2B，2C and 2D in rat brain.Neuroreport，1995，7:45-48.

6 A Villringer，Dirnagl U.Pathophysiology of cerebral ischemia.Z Arztl Fortbild Qualitatssich，1999，93:164-168.

7 徐鐵軍，樊紅彬，張鳳真，等.前腦缺血再灌流后大鼠海馬NMDA受體亞單位NR2A和NR2B蛋白質(zhì)表達(dá)的變化.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2002，18:110-116.

8 劉志安，徐鐵軍，張鳳真，等.短暫性前腦缺血后大鼠海馬各區(qū)NMDA受體亞單位NR 2A和NR 2B mRNA的表達(dá)變化.神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2004，20:153-157

9 Hossmann KA.Disturbances of cerebral protein synthesis and ischemic cell death.Prog Brain Res，1993，96:161-177.

10 Jamison JT，Kayali F，Rudolph J，et al.Persistent redistribution of poly-adenylated mRNAs correlates with translation arrest and cell death following global brain ischemia and reperfusion.Neuroscience，2008，154:504-520.

11 Wolf-Yadlin A，Sevecka M ，Macbeath G.Dissecting protein function and signaling using protein microarrays.Curr Opin Chem Biol，2009，72:679-683.

12 Hou ST，MacManus JP.Molecular mechanisms of cerebral ischemia-induced neuronal death.Int Rev Cytol，2002，221:93-148.

13 Jamison JT，Kayali F，Rudolph J，et al.Persistent redistribution of polyadenylated mRNAs correlates with translation arrest and cell death following global brain ischemia and reperfusion.Neuroscience ，2008，154:504-520.

14 Burda J，Hrehorovska M，Bonilla LG，et al.Role of protein synthesis in the ischemic tolerance acquisition induced by transient forebrain ischemia in the rat.Neurochem Res，2003，28:1213-1219.

15 Schwaninger M，Inta I，Herrmann O.NF-kappaB signaling in cerebral ischaemia.Biochem Soc Trans，2006，34:1291-1294.