齊戰(zhàn) 楊大運(yùn) 刑亞威 劉俊霞 張?jiān)禄?/p>

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的75%以上，是全球范圍內(nèi)引起癌癥死亡的主要原因，侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是肺癌臨床治療的難點(diǎn)，而其機(jī)制尚不清楚，因此研究肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制及探討新的可行的治療方案具有極其重要的臨床意義。Raf激酶抑制蛋白(raf kinase inhibitor protein，RKIP)屬于高度保守的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(phosphatidyl ethanolamine binding protein，PEBP)家族，廣泛存在于多種生物中。RKIP參與Raf-MEK1/2-ERK1/2、G蛋白、NF-κB等多條信號(hào)傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，還通過抑制G蛋白藕聯(lián)受體激酶-2(GPCR-2)來發(fā)揮受體信號(hào)調(diào)節(jié)器的作用。RKIP在細(xì)胞信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用受到了人們的廣泛關(guān)注，特別是發(fā)現(xiàn)RKIP具有抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用，被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。但RKIP在肺癌中的研究報(bào)道較少。本研究運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)RKIP在肺癌及正常肺組織中的表達(dá)，分析RKIP與肺癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院確診為原發(fā)性支氣管肺癌手術(shù)切除標(biāo)本83例，取癌組織中心為癌組織，與癌組織相距最遠(yuǎn)處為正常肺組織，標(biāo)本65例。所有病例均經(jīng)病理證實(shí)，患者術(shù)前未接受過放、化療。標(biāo)本用10%的甲醛固定，石蠟包埋。癌組織:男48例，女35例;年齡33～75歲，平均年齡53.7歲。按照 AJCC和UICC分期標(biāo)準(zhǔn):鱗癌36例，腺癌47例;高分化25例、中分化23例、低分化35例;Ⅰ+Ⅱ期38例，Ⅲ+Ⅳ期45例;根據(jù)有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性43例，陰性40例。其中80例有完整隨訪資料，隨訪截止日期為2011年1月，生存期的計(jì)算從手術(shù)日期到隨訪截止日期，或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 方法 主要試劑:山羊抗人RKIP多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國)，過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素(SP)試劑盒(北京中衫金橋生物技術(shù)公司)。免疫組織化學(xué)染色:對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組化鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perioxidase，S-P)法測(cè)定。免疫組織化學(xué)染色程序按試劑盒說明書進(jìn)行，主要包括石蠟切片、常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、山羊血清封閉、滴加一抗、二抗及鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復(fù)合物、DAB顯色、對(duì)比染色封片。同時(shí)設(shè)陽性和陰性對(duì)照:陽性對(duì)照為試劑公司提供的強(qiáng)陽性標(biāo)本切片，陰性對(duì)照采用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗。用光學(xué)顯微鏡觀察免疫組織化學(xué)染色的切片，選取5個(gè)具有代表的高倍鏡視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取算術(shù)平均值。RKIP蛋白表達(dá)強(qiáng)度根據(jù)陽性物質(zhì)的著色深淺及面積判斷。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按照Shumizu方法。對(duì)每張切片陽性細(xì)胞數(shù)的陽性強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記0、1、2、3分，著色陽性面積按無著色、著色＜1/3、1/3～ 2/3、＞2/3 分別記0、1、2、3 分，然后根據(jù)2項(xiàng)記分之和判斷其結(jié)果:＞3分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RKIP蛋白在正常肺組織與NSCLC癌組織中的表達(dá) 83例肺癌組織中，66例表達(dá)陰性或少數(shù)微弱表達(dá)，僅17例呈高表達(dá)，陽性表達(dá)率20.5%(17/83)，RKIP蛋白的陽性表達(dá)在高倍鏡下呈棕黃色顆粒，主要位于腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)，多呈弱陽性和陰性，基質(zhì)表達(dá)較少。65例癌旁正常肺組織中，23例表達(dá)陰性或少數(shù)微弱表達(dá)，42例呈陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率64.6%(42/65)。肺癌組織中RKIP的表達(dá)與正常肺組織中的表達(dá)比較(χ2=29.617)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表1。

表1 肺癌、正常肺組織中RKIP蛋白表達(dá)結(jié)果 例(%)

2.2 RKIP與臨床病理特征的關(guān)系 RKIP蛋白的陽性表達(dá)與腫瘤瘤體大小、性別以及大量吸煙史無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。肺癌高分化者RKIP蛋白陽性表達(dá)率高于低分化者(P＜0.05)，肺癌中RKIP陽性表達(dá)率隨著臨床TNM分期增加而下降，分期越晚表達(dá)率越低，各期間RKIP的陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，術(shù)后生存期＜2年者RKIP陽性表達(dá)率明顯低于≥2年者(P＜0.05)，肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者RKIP陽性表達(dá)明顯低于非轉(zhuǎn)移者(P＜0.05)。見表2。

表2 RKIP蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是基因調(diào)控下的多階段、多因素、多步驟過程，通過腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的過度表達(dá)或下調(diào)，以及一系列基因產(chǎn)物的參與，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的整個(gè)過程進(jìn)行調(diào)控。侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)行為，控制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。因此，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)與腫瘤轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的基因，阻斷信號(hào)傳導(dǎo)通路將成為癌癥治療新策略。研究發(fā)現(xiàn)，生長因子的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］。

RKIP是一個(gè)高度保守、廣泛表達(dá)的小分子胞漿蛋白，調(diào)節(jié)許多重要的生理功能如心臟和神經(jīng)功能，精子發(fā)生和生殖行為［1］。RKIP能抑制乳癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與抑制Ra-/MEK/ERK或NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。RKIP的表達(dá)水平不僅與人類多種腫瘤的轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)，而且與腫瘤預(yù)后相關(guān)。RKIP表達(dá)下調(diào)/缺失的患者預(yù)后差。

Li等［2］應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)原發(fā)性乳腺癌及乳腺轉(zhuǎn)移癌中RKIP的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RKIP蛋白表達(dá)主要在細(xì)胞漿，部分在細(xì)胞核，在正?；蛄夹匀橄偕掀ぜ?xì)胞中表達(dá)率高，而侵襲性癌的表達(dá)明顯減少。在淋巴結(jié)陽性的原發(fā)腫瘤中，RKIP陽性表達(dá)率為31.58%，而相對(duì)應(yīng)的來自于同一標(biāo)本的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，RKIP的陽性表達(dá)率為10.53%，研究顯示RKIP的表達(dá)在轉(zhuǎn)移癌中明顯減少或缺失。結(jié)果表明，RKIP的是人類乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因。Fu等［3］對(duì)原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性前列腺癌和非癌性前列腺組織的組織芯片進(jìn)行RKIP免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性前列腺癌中RKIP的表達(dá)明顯下降。原發(fā)癌中高水平表達(dá)RKIP的患者7年復(fù)發(fā)率＜10%，而低水平表達(dá)RKIP的患者復(fù)發(fā)率為50%，RKIP低表達(dá)是前列腺癌復(fù)發(fā)的強(qiáng)陽性預(yù)后因子，多變量分析表明RKIP是一種獨(dú)立的預(yù)后因子，RKIP可作為前列腺癌的1個(gè)新的診斷標(biāo)志物 。Al-Mulla等［4］應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸癌標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)79例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌標(biāo)本中僅12例RKIP陽性表達(dá)，RKIP的表達(dá)只與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤部位及Duke’s分期無關(guān)，隨訪結(jié)果顯示:RKIP陽性表達(dá)組中位生存期長，說明RKIP表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后有關(guān);Wang等［5］應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)RKIP在非腫瘤性胃組織，胃癌組織中的表達(dá)和評(píng)價(jià)其在胃癌發(fā)生及轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果顯示:40例非腫瘤性胃組織中，RKIP表達(dá)陽性率為87.5%，75例胃癌組織中，RKIP表達(dá)陽性率為52%，26例轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織標(biāo)本中，RKIP表達(dá)陽性率為19.2%，RKIP在非腫瘤性胃組織中高表達(dá)，在轉(zhuǎn)移性胃癌組織中低表達(dá)，表明RKIP在胃癌侵襲轉(zhuǎn)移中的發(fā)揮作用。韓海勃等［6］在mRNA和蛋白水平分別檢測(cè)了多個(gè)人肺癌細(xì)胞系RKIP表達(dá)，結(jié)果顯示，存在轉(zhuǎn)移性的A549、PG、Calu6細(xì)胞系中RKIP表達(dá)量呈顯著的下調(diào)趨勢(shì)，且轉(zhuǎn)移性較高的A549細(xì)胞系下調(diào)最明顯。提示RKIP的低表達(dá)與肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

RKIP是一個(gè)潛在的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白，然而，RKIP在肺癌中的作用報(bào)道較少。本研究應(yīng)用免疫組化方法研究肺癌和癌旁正常肺組織中RKIP的表達(dá)，評(píng)估它在肺癌生成和轉(zhuǎn)移中的作用，本研究結(jié)果顯示:癌旁正常肺組織RKIP高表達(dá)率64.6%，肺癌中RKIP高表達(dá)率20.5%，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織RKIP高表達(dá)率11.6%，RKIP低表達(dá)率30.0%，RKIP低表達(dá)與肺癌的分化程度、臨床分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及生存期有關(guān)，RKIP的表達(dá)水平隨著肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)展而呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，提示RKIP表達(dá)下調(diào)與肺癌組織的惡性程度有關(guān)，且RKIP低表達(dá)者生存期短。說明RKIP在抑制肺癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。

1 Keller ET，F(xiàn)u Z，Brennan M.The role of Raf kinase inhibitor protein(RKIP)in health and disease.Biochem Pharmacol，2004，68:1049-1053.

2 Li HZ，Gao Y，Zhao XL，et al.Effects of Raf kinase inhibitor protein expression on metastasis and progression of human breast cancer.Mol Cancer Res，2009，7:832-840.

3 Fu Z，Kitagawa Y，Keller ET，et al.Metastasis suppressor gene Raf kinase inhibitor protein(RKIP)is a novel prognostic marker in prostate cancer.Prostate，2006，66:248-256.

4 Al-Mulla F，Hagan S，Behbehani AI，et al.Raf kinase inhibitor protein expression in a survival analysis of colorectal cancer patients.J Clin Oncol，2006，24:5672-5679.

5 Wang J，Yang YH，Wang AQ，et al.Immunohistochemical detection of the Raf kinase inhibitor protein in nonneoplastic gastric tissue and gastric cancer tissue.Med Oncol，2010，27，2:219-223.

6 韓海勃，張志謙，趙威.RKIP蛋白在多個(gè)人肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)下調(diào).基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27:849-852.