翟俊輕 張立志 李靜 劉開揚(yáng)

自從1961年英國(guó)學(xué)者Jevons報(bào)道了世界上首株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)以來(lái)，MRSA和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球(methicillin-resistant coagu-lase-ngeative staphylococci，MRCNS)在世界各地廣泛傳播，其分離率逐年增加。20世紀(jì)80年代末90年代初以來(lái)，葡萄球菌較以前感染明顯增多，尤其是耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)。耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床抗感染治療造成極大困難。本文旨在比較我院患者M(jìn)RS對(duì)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替考拉寧、利福平、左氧氟沙星的耐藥性，為臨床預(yù)防、治療該菌感染提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 選擇我院2007年12月至2008年5月門診及住院患者送檢的標(biāo)本(包括分泌物、膿、痰、血液、尿液、腦脊液等)，臨床分離MRS 31株，按CLSI標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，葡萄球菌用頭孢西丁紙片法檢測(cè)出MRS。

1.2 試劑 利奈唑胺(30 μg/片)紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，替考拉寧(30μg/片)、利福平(5μg/片)、左氧氟沙星(5μg/片)、頭孢西丁(30μg/片)紙片購(gòu)自北京天壇微生物技術(shù)開發(fā)公司，萬(wàn)古霉素(30 μg/片)紙片以及藥敏培養(yǎng)基(MH瓊脂)購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 方法 紙片擴(kuò)散法按CLSI標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，MRSA:頭孢西丁的抑菌圈直徑≤19 mm為耐藥;MRCNS:頭孢西丁的抑菌圈直徑≤24 mm為耐藥。采用Kerby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定所有菌株對(duì)利奈唑胺等5種抗菌藥物的耐藥性。在MH平板上涂布0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z細(xì)菌后，用藥敏紙片專用加樣器將藥敏紙片均勻分散放置在平板上，35℃培養(yǎng)18～24 h。精確量取(坐標(biāo)紙量取法，量3次取其平均值)抑菌圈直徑，以ATCC25923為質(zhì)控菌株，藥敏結(jié)果依據(jù)CLSI/NCCLS(2006年)判斷。

2 結(jié)果

K-B法測(cè)得31株MRS對(duì)5種抗菌藥物的抑菌圈情況:利奈唑胺與萬(wàn)古霉素、替考拉寧敏感率均為100%，利福平敏感率為45.16%，左氧氟沙星敏感率為16.13%。利奈唑胺與萬(wàn)古霉素、替考拉寧抗菌效果優(yōu)于其他2種藥物。見表1、2。

3 討論

細(xì)菌耐藥性已成為全球醫(yī)藥界關(guān)注的問(wèn)題，具有重要臨床意義的耐藥菌有青霉素耐藥的肺炎鏈球菌、甲氧西林耐藥的葡萄球菌、萬(wàn)古霉素耐藥的腸球菌、β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的革蘭氏陰性桿菌。這些耐藥菌不僅呈逐年上升趨勢(shì)，并且常為多重耐藥菌株，致使這些菌種所致感染的治療成為臨床上的難題，對(duì)感染患者的健康和生命直接構(gòu)成威脅，因此控制和減緩耐藥細(xì)菌的增長(zhǎng)已成當(dāng)務(wù)之急。

表1 5種藥物對(duì)MRS的抑菌圈直徑 mm

表2 MRS對(duì)5種藥物的敏感性 n=31，株(%)

MRS包括MRSA和MRCNS。MRS對(duì)甲氧西林的耐藥性主要是由PBP2α所介導(dǎo)的。編碼PBP2α，從而介導(dǎo)葡萄球菌對(duì)甲氧西林耐藥性的是位于細(xì)菌染色體上的mecA基因，這種基因只存在于MRS中。葡萄球菌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要通過(guò)質(zhì)粒介導(dǎo)、靶位改變、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，改變核糖體結(jié)構(gòu)和DNA促螺旋酶與拓?fù)洚悩?gòu)酶的變異及主動(dòng)外排系統(tǒng)的參與而使其耐藥性增加;耐藥質(zhì)粒不但可在同種菌間傳播，也可在不同細(xì)菌間傳播，導(dǎo)致耐藥迅速?gòu)V泛的散布，這也是細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)的重要原因［1］。葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥是由于其攜帶的mecA基因所表達(dá)的一種低親和力的青霉素結(jié)合蛋白PBP2α造成的，mecA基因位于一個(gè)稱為葡萄球菌盒式染色體(staphylococcal cassette chromosome，SCC)的移動(dòng)基因組件上［2］。本次檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌時(shí)采用頭孢西丁紙片法。耐甲氧西林葡萄球菌檢測(cè)方法很多，有頭孢西丁紙片法、苯唑西林紙片法、苯唑西林-鹽瓊脂篩選法、PBP2α膠乳凝集法等表型檢測(cè)，還有PCR、探針雜交法快速檢測(cè)。苯唑西林法隨著β-內(nèi)酰胺酶含量增加被破壞導(dǎo)致假陽(yáng)性發(fā)生;苯唑西林不能檢測(cè)異質(zhì)性MRSA，因?yàn)閷?duì)大多數(shù)非β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)為敏感而被認(rèn)為是甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)［3］導(dǎo)致MRSA漏檢。苯唑西林-鹽瓊脂篩選法簡(jiǎn)便可行，敏感度極高，常用作校正其他方法的標(biāo)準(zhǔn);本法因氯化鈉濃度高(40 g/L)，造成高滲環(huán)境，時(shí)間延長(zhǎng)至48 h，MSSA易產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶緩慢水解苯唑西林，致細(xì)菌生長(zhǎng)，檢測(cè)特異性下降。PBP2α膠乳凝集法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，檢測(cè)全程只需15 min，但由于檢測(cè)試劑依賴進(jìn)口費(fèi)用昂貴，限制了在臨床中的應(yīng)用。PCR檢測(cè)mecA基因，雖然會(huì)有基因不表達(dá)的情況，但對(duì)作為分子標(biāo)志的mecA基因的檢測(cè)仍是目前認(rèn)為最可靠的檢測(cè)方法，是判定MRSA和MRCNS的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。MecA基因檢測(cè)(PCR法)和頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測(cè)MRSA、MRCNS的陽(yáng)性率無(wú)差別。探針雜交法目前還處于研究階段，還未應(yīng)用于臨床。頭孢西丁更易誘導(dǎo)mecA基因的表達(dá)。在紙片擴(kuò)散試驗(yàn)中無(wú)中介類別，易判讀終點(diǎn)，是臨床應(yīng)用的首選方法［5，6］。

利奈唑胺與50 S核糖體亞基的特殊位點(diǎn)結(jié)合，不可逆地阻止蛋白合成初期絡(luò)合物的形成，盡管其結(jié)合位點(diǎn)與氯霉素和林可霉素相近(均作用于細(xì)菌50 S核糖體亞單位)，終止蛋白合成。但他們的作用機(jī)制不同，氯霉素抑制肽鍵的形成，利奈唑胺作用于翻譯起始階段，干擾包含mRNA、30 S核糖體、起始因子和fMet-tRNA等復(fù)合物的形成，從而抑制細(xì)菌合成蛋白，以往的抗菌藥物均未將此階段作為抑制生物蛋白合成的靶位［7，8］，這種不同的作用機(jī)制使利奈唑胺與氯霉素和林可霉素之間不易產(chǎn)生交叉耐藥性。萬(wàn)古霉素和替考拉寧屬于糖肽類抗生素，結(jié)構(gòu)基本骨架相同。從部分文獻(xiàn)的結(jié)果及目前臨床耐藥菌株的分布情況看，萬(wàn)古霉素是MRSA及MRSE感染所致疾病的首選藥物，但是，近年來(lái)，不斷有報(bào)道MRSA對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性降低，而且Garrett等［9］先后報(bào)道表皮葡萄球菌與溶血葡萄球菌對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性降低。替考拉寧主要用于治療革蘭陽(yáng)性細(xì)菌的感染，是目前臨床上為數(shù)不多的仍對(duì)多重耐藥葡萄球菌和腸球菌具有抗菌活性的藥物之一。有學(xué)者認(rèn)為，由于萬(wàn)古霉素大量應(yīng)用于對(duì)MRS感染的治療，可能會(huì)導(dǎo)致MRS對(duì)萬(wàn)古霉素敏感性的下降并最終對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥，因而交替使用利奈唑胺、萬(wàn)古霉素和替考拉寧可能會(huì)延緩這種耐藥情況的出現(xiàn)［10］。

國(guó)外在一項(xiàng)院內(nèi)獲得性MRS感染的隨機(jī)研究中發(fā)現(xiàn)，治療組給予利奈唑胺600 mg，靜脈注射，12 h/次;對(duì)照組給予萬(wàn)古霉素1 g，靜脈注射，12 h/次。其主要感染部位為肺和皮膚軟組織。結(jié)果，MRSA的治療有效率分別為78.5%(51/65)和72.2%(57/79)。2 組的胃腸外給藥時(shí)間(5.4 d 和 14.8 d，P＜0.01)和住院時(shí)間(8 d和16 d，P＜0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［11］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室采用K-B法檢測(cè)藥物對(duì)MRS抑菌圈大小分析利奈唑胺的作用效果優(yōu)于萬(wàn)古霉素。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析利奈唑胺抑菌圈明顯大于其他幾種藥物，甚至有的抑菌圈是敏感界限的兩倍，鑒于這種情況的存在，因此建議給臨床提供藥敏結(jié)果是不能單純報(bào)告敏感、中敏和耐藥，而是用最新的一種提法極度敏感、高度敏感、敏感、中度敏感和耐藥來(lái)報(bào)告結(jié)果，以便為臨床治療提供更好的用藥信息，延緩藥物耐藥性的產(chǎn)生。

針對(duì)近年來(lái)葡萄球菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，我們要對(duì)細(xì)菌耐藥性提高重視，用藥前進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)，合理使用抗生素，延緩或避免細(xì)菌對(duì)一種又一種抗生素耐藥。有人提倡，在可能情況下，應(yīng)選用喹諾酮類藥物，如左氧氟沙星、利福平、呋喃妥因等聯(lián)合治療多重耐藥MRS，在這些藥物治療失敗后，再選用萬(wàn)古霉素等藥物［12］。臨床檢驗(yàn)工作者在實(shí)驗(yàn)工作中應(yīng)增加藥敏試驗(yàn)的抗生素品種，為臨床醫(yī)生提供更合適的敏感抗生素，這樣才能保證治療效果以及防止耐藥菌株的進(jìn)一步增加。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室對(duì)5種藥物抑菌圈大小分析發(fā)現(xiàn)利奈唑胺、萬(wàn)古霉素、替考拉寧為治療MRS的首選藥物。

1 何代平，胡美玲，央娜，等.高原地區(qū)醫(yī)院耐甲氧西林葡萄球菌感染及其耐藥譜分析.高原醫(yī)學(xué)雜志，2005，15:57-59.

2 周義正，李向陽(yáng)，楊錦紅，等.臨床分離葡萄球菌中mecR1和mecI基因突變?nèi)笔а芯?醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36:46-49.

3 Felten A，Grandry B，Lagrange PH，et al.Evalution of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus:a disk difusion method with cefoxitin and moxalactam，the Vitek 2 system，and the MRSA-Screen latex agglutination test.J Clin Microbiol，2002，40:2766-2771.

4 沈定霞，羅燕萍，張有江，等.我院近十年細(xì)菌流行分布及耐藥性監(jiān)測(cè).中華臨床醫(yī)藥衛(wèi)生雜志，2004，2:15-18.

5 宋焰桃，徐元宏.四種初篩試驗(yàn)檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌的評(píng)價(jià).熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7:1170-1172.

6 楊錦紅，周義正，朱敏敏，等.基因擴(kuò)增和3種表型篩查法檢測(cè)耐甲氧西林葡萄球菌的應(yīng)用評(píng)價(jià).醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36:42-45.

7 Linden P.Ues of linezolid for gram-positive infections.Infect Med，2002，19:25-32.

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10 逢崇杰，鞏路，田彬，等.替考拉寧和萬(wàn)古霉素對(duì)臨床分離耐甲氧西林葡萄球菌體外抗菌活性比較.中國(guó)抗感染化療雜志，2005，5:360-361.

11 Linden P.Use of linezolid for Gram-positive infections.Infect Med，2002，19:25.

12 余方友，胡龍華，譚絲明，等.金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥譜變遷分析.中華傳染病雜志，2004，22:57-60.