王志波 王麗芳 肖紅玲 楊繼軍 張瑞娟 肖麗梅 楊云峰

高脂血癥(hyperlipemia，HLP)是一種脂質(zhì)代謝紊亂性疾病，研究表明，高脂血癥會(huì)使巨噬細(xì)胞活化，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血清一氧化氮(NO)濃度降低，血清內(nèi)皮素(ET)含量增高［1－3］。本文取豐隆、曲池、三陰交穴針刺治療高脂血癥，系多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的配穴方法，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制，本文將其對(duì)高脂血癥模型小鼠血清NO、ET含量的影響結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 體重18～22 g的清潔級(jí)昆明小鼠120只，雄性，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供，合格證號(hào)scxk(鄂)2004-0007。飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組:正常組40只、模型組40只、針刺組20只和藥物組20只。

1.2 主要儀器與試劑 1-15K型離心機(jī)，德國(guó)Sigma;Humalyzer 2000型半自動(dòng)生化儀，德國(guó)Human;TGL-16B型離心機(jī)，上海安亭;FJ-2020型γ射線免疫計(jì)數(shù)器，國(guó)營(yíng)262廠;LH202H韓氏電針儀，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司。

辛伐他汀膠囊(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào):070101);血清三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量測(cè)定，均為中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品;ET放射免疫試劑盒，南京建成生物工程研究所第一分所;NO測(cè)定試劑盒，為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)［4］采用高脂飲食誘導(dǎo)法，并在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行改良。4組動(dòng)物飼養(yǎng)于18～22℃明暗各12 h的清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，自由飲水進(jìn)食，正常組喂飼普通平價(jià)飼料，其余3組喂飼高脂飼料，飼養(yǎng)15 d后，選取正常組和模型組小鼠各20只，斷頭采血測(cè)定血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量，通過(guò)2組數(shù)據(jù)對(duì)比證實(shí)造模成功，實(shí)驗(yàn)繼續(xù)。高脂飼料配方為:膽固醇1.5%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料88.5%。普通平價(jià)飼料和高脂飼料均由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 治療方法

1.4.1 針刺組:造模成功后，在不作麻醉的情況下，將實(shí)驗(yàn)小鼠固定于自制束鼠器上，參照《現(xiàn)代中獸醫(yī)大全》并模擬人體經(jīng)穴定位取穴，取小鼠雙側(cè)“豐隆”、“三陰交”和“曲池”穴。常規(guī)消毒，選用28 G 15 mm針灸針，針刺后接通LH202H韓氏電針儀，采用疏密波，頻率為疏波2 Hz，密波15 Hz，輸出強(qiáng)度0～2 mV，以小鼠肢體微顫、能耐受為度，10 min/次，1次/d;同時(shí)按0.2 ml/10 g計(jì)算，灌胃與藥物組同體積蒸餾水1次/d，連續(xù)10 d。

1.4.2 藥物組:參照文獻(xiàn)［5］，按照 6.6 mg·kg－1·d－1計(jì)算得出藥量，在造模成功后給實(shí)驗(yàn)小鼠灌服辛伐他汀，1次/d;并用與針刺組同樣方法將實(shí)驗(yàn)小鼠在自制束鼠器上固定10 min，1 次/d，連續(xù)10 d。

1.4.3 模型組、正常組:用與針刺組同樣的方法，在造模成功后將實(shí)驗(yàn)小鼠在自制束鼠器上固定10 min，1次/d;同時(shí)按0.2 ml/10 g計(jì)算，灌胃與藥物組同體積蒸餾水1次/d，連續(xù)10 d。

1.5 取材及指標(biāo)檢測(cè) 造模第15天取正常組、模型組小鼠各20只，禁食不禁水12 h，斷頭采血，加入預(yù)冷的、加有1%肝素(每毫升全血20 μl)和抑肽酶(每毫升全血500 U)的塑料試管中，4℃、3000 r/min，離心 5 min，提取上清液測(cè)定血清 TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。末次針刺、給藥后，禁食不禁水12 h，斷頭采血，加入預(yù)冷的、加有1%肝素(每毫升全血20 μl)和抑肽酶(每毫升全血500 U)的塑料試管中，4℃、3000 r/min，離心5 min，提取上清液測(cè)定血清ET、NO含量。

血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量測(cè)定:酶學(xué)終點(diǎn)法測(cè)血清TG、TC的含量;磷鎢酸-鎂沉淀法測(cè)血清HDL-C含量;聚乙烯硫酸沉淀法測(cè)血清LDL-C含量。所有測(cè)定步驟和計(jì)算公式均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

血清ET、NO含量的測(cè)定:采用放射免疫分析方法測(cè)定血清ET含量，采用硝酸還原酶法測(cè)定血清NO含量，所有測(cè)定步驟和計(jì)算公式均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較用單因素方差分析，后用單因素q檢驗(yàn)做組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模第15天正常組和模型組小鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較 造模第15天模型組小鼠血清TC、TG和LDL-C含量均高于正常組(P＜0.05)，血清HDL-C含量低于正常組(P＜0.01)，提示高脂血癥小鼠模型造模成功。見表1。

表1 造模第15天正常組和模型組小鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較n=20，mmol/L，

表1 造模第15天正常組和模型組小鼠血清 TC、TG、HDL-C、LDL-C含量比較n=20，mmol/L，

注:與正常組比較，*P＜0.05，#P＜0.01

TC TG HDL-C LDL-C正常組組別3.08±0.74 0.70±0.21 0.94±0.30 1.83±0.36模型組 5.72±0.85# 1.31±0.32# 0.60±0.26* 2.68±0.55#

2.2 針刺豐隆、曲池、三陰交穴對(duì)高脂血癥小鼠血清ET、NO含量的影響 模型組小鼠血清ET含量高于正常組，NO含量低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);針刺組和藥物組血清ET的含量均低于模型組，NO含量均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);針刺組ET含量低于藥物組，NO含量高于藥物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

表2 4組小鼠血清ET、NO含量比較n=20，

表2 4組小鼠血清ET、NO含量比較n=20，

注:與正常組比較，*P＜0.01;與模型組比較，#P＜0.05，△P＜0.01;與藥物組比較，☆P＜0.05

組別 ET(Pg/ml) NO(μmol/L)正常組 46±9 87±6模型組 67±12* 64±9*針刺組 44±5△☆ 85±10△☆藥物組 56±12# 76±9△

3 討論

HLP是一種脂質(zhì)代謝異常性疾病，主要表現(xiàn)為血清中TC、TG、LDL-C的升高以及HDL-C降低，并對(duì)人體的血管內(nèi)皮系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重影響。

內(nèi)皮可合成和分泌多種血管活性物質(zhì)，ET即是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的強(qiáng)烈而持久收縮血管的一種多肽，和NO是與血管舒張和收縮功能密切相關(guān)的兩種細(xì)胞因子，在動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的發(fā)病過(guò)程中起著重要的作用［6］。ET可以通過(guò)激動(dòng)相應(yīng)受體興奮血管平滑?。?］，引起血管收縮，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、損傷。NO是調(diào)節(jié)血管平滑肌張力和血流的主要因子［8］，NO除調(diào)解血管的張力外，還具有抗氧化，抑制血小板和白細(xì)胞在內(nèi)膜的粘附、聚集和激活，阻止附壁血栓形成等作用，NO水平下降，是AS等血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，正常時(shí)ET與NO處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。

HLP時(shí)，由于低密度脂蛋白含量增加，容易被氧化生成氧化低密度脂蛋白(oxLDL)。oxLDL是一種超氧陰離子自由基(O－2)，具有強(qiáng)烈的引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，oxLDL又可抑制內(nèi)皮細(xì)胞NO的釋放，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和釋放ET，從而使平滑肌細(xì)胞進(jìn)一步遷移與增殖，血管收縮增強(qiáng)［9］。因此，血清ET和NO含量，可以反應(yīng)血管平滑肌收縮與舒張狀態(tài)、血管張力及血流暢通程度，對(duì)于研究針刺穴位治療高脂血癥的作用機(jī)理，具有重要意義。

本文從中醫(yī)角度認(rèn)為高脂血癥的發(fā)病以脾虛不運(yùn)為本，痰濁之邪為標(biāo)，屬于本虛標(biāo)實(shí)之證。由于脾虛不運(yùn)，調(diào)節(jié)機(jī)能減退，排濁邪能力下降(如血清中HDL-C、NO含量下降)，則痰濁之邪蓄積(如血清中的TC、TG、LDL-C的含量升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放ET增加)。脾虛痰濁常互為因果，形成虛實(shí)錯(cuò)雜的惡性循環(huán)是高脂血癥進(jìn)一步發(fā)展和加重的關(guān)鍵。針對(duì)上述認(rèn)識(shí)，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，擬以豐隆、曲池、三陰交三穴合用，共湊健脾化痰、通腑泄?jié)嶂?，以?biāo)本兼治。其中豐隆穴具有健脾化痰、利氣寬胸、和胃降逆、調(diào)理氣血之作用，尤其化痰之用最為顯著，是祛痰要穴，現(xiàn)代研究表明針刺豐隆具有調(diào)節(jié)血脂的特異性，可顯著降低血清中膽固醇［10］含量;三陰交穴具有健脾利濕、補(bǔ)益肝腎、活血化瘀作用，現(xiàn)代研究表明針刺三陰交穴可以增強(qiáng)膽固醇的分解和排泄，減少其合成和吸收，改變其在血清和組織中的分布，從而降低血液中膽固醇的含量［11］;曲池穴可通腑泄?jié)幔鍩崂麧?，調(diào)和氣血，有報(bào)道表明穴位注射曲池有降低患者血脂的功效［12］。

研究結(jié)果顯示，采用高脂飲食復(fù)制的HLP模型小鼠血清中ET含量較正常組明顯升高，與血脂水平呈正相關(guān);NO含量明顯降低，與血脂水平呈負(fù)相關(guān)，表明模型組小鼠體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生、抗氧化損傷能力下降。且在高脂血癥發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中ET合成與分泌增加，NO的合成與釋放減少，從而導(dǎo)致血管痙攣收縮，血管張力變大，血液循環(huán)障礙，血小板聚集、附壁血栓形成等病理變化。針刺豐隆、曲池、三陰交穴可降低模型小鼠血清ET含量，提高NO含量，與模型組比較有顯著性意義，說(shuō)明該方法可改善自由基代謝，從而減輕高脂血癥引發(fā)的氧化損傷，且具有調(diào)節(jié)血管平滑肌收縮與舒張狀態(tài)，抑制血小板聚集，防止單核細(xì)胞等對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、損傷，抑制附壁血栓形成，以維持血管張力及血液運(yùn)行的暢通，從而達(dá)到保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的作用。

1 吳峻，孫明，周宏研.高脂血癥對(duì)VEGF與NO濃度的影響及降脂治療后的變化.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13:12-14.

2 楊牧祥，田元祥，馬全慶，等.脂調(diào)康膠囊對(duì)高脂血癥大鼠血清ET-1的影響.山東中醫(yī)雜志，2003，22:491-492.

3 齊鳳軍.電針對(duì)高脂血癥大鼠血清ET、TXA2、PGI2水平及動(dòng)脈內(nèi)皮保護(hù)的影響.針灸臨床雜志，2007，23:44-45.

4 邢巖，李智慧，田慶偉，等.番茄紅素對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥小鼠的保護(hù)作用.中國(guó)食品添加劑實(shí)驗(yàn)研究，2007，2:81-84.

5 陳奇主編.中藥藥理研究方法學(xué).第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006.521.

6 張英，張 波，王柏欣，等.雌激素對(duì)去卵巢大鼠血清NO，NOS及ET-1水平的影響.標(biāo)記免疫分析與臨床，2003，10:156-157.

7 張慶，邵華強(qiáng)，谷艷，等.芪丹合劑對(duì)高脂血癥大鼠血清ET和CGRP的影響.實(shí)用醫(yī)藥雜志，2005，22:911.

8 毛孫忠，范小芳，吳小脈，等.麥綠素對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂及MDA、SOD、ET-1、NO 的影響.食品科學(xué)，2007，28:306-308.

9 李寶華，鄭廣娟，張文高，等.軟脈降脂膠囊對(duì)實(shí)驗(yàn)性高脂血癥大鼠血脂及MDA、SOD、NO的影響.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2004，2:220-221.

10 張?zhí)品ǎf(wàn)文俊，張紅星，等.電針豐隆穴治療高脂血癥的多中心觀察.中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10:18.

11 陳太福.三陰交為主針刺治療單純性高脂血癥.黑龍江中醫(yī)藥，2003:44.

12 吳紅軍，傅莉萍，王瑞華.穴位注射治療高脂血癥療效觀察.上海針灸雜志，2005，24:26.