霍仕霞，凱賽爾·阿不都克熱木，高 莉，彭曉明，王宇卿，閆 明

(1.新疆維吾爾醫(yī)藥研究所，新疆烏魯木齊 830049;2.石河子大學藥學院，新疆 石河子 832000)

中藥藥代動力學一直是新藥研究的熱點，以往對中藥有效成分研究，單純地從含量及藥效去評價一個工藝的好壞，而忽略了藥物在體內吸收、分布的特點。本研究以治療白癜風的中藥補骨脂為研究對象，經過不同工藝處理，得到補骨脂常規(guī)粉末、超微粉末、半仿生提取物、水提取物，進行了主要活性成分補骨脂素、異補骨脂素在大鼠體內的藥代動力學研究，建立了補骨脂素、異補骨脂素血藥濃度的HPLC分析方法，分別闡明了補骨脂不同工藝產物在大鼠體內的代謝過程，比較藥代動力學參數(shù)，以期揭示補骨脂藥效成分在大鼠體內的變化規(guī)律，從藥代動力學特征比較不同工藝的主成分吸收程度，優(yōu)選最佳的工藝，為臨床前研究提供參考，尋求一種科學簡便的新的工藝評價方法。

1 實驗材料

DHQ-A型多用混合器(江蘇泰縣醫(yī)療器械廠)，TGL-16B型離心機(上海安亭科學儀器廠)，BP211D十萬分之一電子天平(Sartorius)，超純水儀，Shimadzu LC-10AD VP泵，Shimadzu SPD-M10A VP二極管陣列檢測器，Shimadzu CTO-10A VP柱溫箱，Shimadzu CLASS VP 6.2S色譜工作站。補骨脂藥材(華康藥業(yè)提供，產地四川)，補骨脂素、異補骨脂素對照品購自中國藥品生物制品檢定所，批號分別為(1107397-200310;0738-200108)，甲醇(色譜純，美國Fisher公司)。健康Wistar大鼠，♂，體質量(200±30)g，新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXY(新)2003-0001。

2 方法與結果

2.1補骨脂不同工藝產物制備

2.1.1常規(guī)粉末稱取干燥至恒重的140目補骨脂常規(guī)粉5.000 g，置25 ml量瓶中，邊攪拌邊加水，強力振搖，得0.2 g·ml－1(生藥)的補骨脂常規(guī)粉混懸液，含補骨脂素0.0191 g，異補骨脂素0.0164 g。

2.1.2超微粉末稱取干燥至恒重的300目補骨脂超微粉5.000 g，制備方法同上，得補骨脂超微粉混懸液，含補骨脂素0.0175 g，異補骨脂素0.0148 g。

2.1.3半仿生提取物稱取干燥至恒重的補骨脂半仿生提取物［1］干浸膏粉1.700 g，制備方法同上，得補骨脂半仿生提取物混懸液，含補骨脂素0.0236 mg，異補骨脂素0.0160 mg。2.1.4水提物稱取干燥至恒重的補骨脂半仿生提取物干浸膏粉1.615 g，制備方法同上，得補骨脂水提物混懸液，含補骨脂素0.0215 mg，異補骨脂素0.0148 mg。

2.2血漿樣品的制備

2.2.1動物分組及準備取健康wistar大鼠24只(♀♂各半)，隨機分組，每組6只，編號記錄體質量。分別為補骨脂常規(guī)粉末組、超微粉組、半仿生提取物組、水提物組。

2.2.2灌胃給藥及血漿收集給藥前禁食12 h，自由飲水。大鼠稱重，按3g·kg－1(生藥)給對應組大鼠灌胃相應的藥液。分別在給藥前及給藥后 0.25、0.5、1、2、3、4、5、6、9、12、14、24 h于大鼠尾靜脈采血，低速離心，分離血漿。取各組各時間點血漿100 μl為待測樣品，置－20℃冰箱中冷凍備用［2］。

2.2.3血漿樣品處理取待測血漿樣品分別加入對照品溶液 200 μl，內標溶液 100 μl，渦漩混勻 10 min，高速離心(1 500 r·min－1)10 min，沉淀血漿中蛋白，取上清液即得血漿樣品供試液［3］。

2.3色譜條件及標準溶液的制備色譜條件見參考文獻［1］。

2.3.1標準品溶液制備精密稱取補骨脂素、異補骨脂素對照品4.26 mg、4.30 mg，分別置于10 ml棕量瓶中加甲醇溶解稀釋至刻度冷藏備用。

Tab 1 The pharmacokinetic parameters of psoralcn and isopsoralcn of different technics

2.3.2內標溶液的制備精密稱取7-甲氧基香豆素對照品1.46 mg置于100 ml棕量瓶中，加甲醇溶解定容。

2.4標準曲線的制備取3項下補骨脂素、異補骨脂素對照品溶液，逐級稀釋得補骨脂素、異補骨脂素混合標準系列溶液。取空白血漿8份，每份100 μl，分別加入上述對照品溶液200 μl，內標溶液 100 μl，按血樣處理方法處理血漿樣品，取上清液進樣20 μl。按照選定的色譜條件分析，記錄色譜圖，分別計算補骨脂素、異補骨脂素與內標物質的峰面積比值Y。建立回歸方程，得:補骨脂素:^Y1=1.898C－0.0598，r=0.9996;線性范圍:0.0341 ～1.7040 mg·L－1;異補骨脂素:^Y2=1.509C－0.0546，r=0.9995;線性范圍:0.0344 ～1.7200 mg·L－1。

2.5方法回收率與精密度［4］取空白血漿100 μl，分別加入200 μl混合標準溶液制備高、中、低3個不同濃度質控樣品(所加入的標液濃度分別為，補骨脂素:4.26、0.852、0.1704 mg·L－1，異補骨脂素:4.30、0.86、0.172 mg·L－1)。每個濃度各6份，分別取各樣品上清液20 μl進樣測定。計算得補骨脂素平均方法回收率分別為104.94%、97.88%、99.30%，異補骨脂素分別為107.68%、94.38%、99.13%;測得3種濃度標準血漿補骨脂素的日內RSD分別為1.51%、1.03%、0.50%(n=6)，日間 RSD分別為2.75%、2.26%、1.20%(n=6);異補骨脂素的日內 RSD分別為1.24%、1.17%、0.63%(n=6)，日間 RSD分別為3.97%、2.50%、1.55%(n=6)，表明該方法的準確度與精密度良好。

2.6血樣的分析測定及藥動學參數(shù)計算取各給藥組各時間點含藥血漿樣品100 μl，按樣品制備方法進行處理，取上清液進樣20 μl，記錄色譜圖。分別計算補骨脂素、異補骨脂素與內標物質的峰面積比值Y，代入標準曲線求得補骨脂素和異補骨脂素的濃度。將各組不同時間點取血測得的血藥濃度－時間數(shù)據用DAS 2.0藥代動力學分析軟件處理，得主要藥代動力學參數(shù)。數(shù)據見Tab 1。血藥濃度－時間曲線見Fig 2，3，擬合的藥－時曲線符合po給藥二室模型。

3 討論

本實驗建立了RP-HPLC法測定補骨脂中的補骨脂素、異補骨脂素在大鼠體內血藥濃度測定方法，并進行了藥代動力學初步研究，以7-甲氧基香豆素作為內標準物，減少系統(tǒng)誤差;試驗中，選擇內標物質時，比較了羥甲香豆素、歐前胡素、聯(lián)苯胺、7-甲氧基香豆素等物質，其中羥甲香豆素、聯(lián)苯胺與含藥血漿中固有成分有干擾;歐前胡素出峰時間太長造成分析周期過長，綜合考慮采用與補骨脂素和異補骨脂素性質類似的7-甲氧基香豆素作為內標物質。

Fig 1 The HPLC chromatograms of reference substance，plasma with reference substance，blank plasm and pastille serum of drug

Fig 2 The drug-time curve of psoralen of different extracts

Fig 3 The drug-time curve of isopsoralen of different extracts8

不同工藝產物中的補骨脂素和異補骨脂素的藥代動力學參數(shù)比較［5－6］，從MRT來看，常規(guī)粉末組＞超微粉組＞水提取物組＞半仿生組，而Tmax為常規(guī)粉末組＞水提取物組＞超微粉組＞半仿生提取物組，但異補骨脂素Tmax超微粉組＞水提取物組，表明常規(guī)粉末較超微粉末在在大鼠體內滯留的時間長，達峰時間也較長，與其粉碎粒徑有很大的關系，其次，補骨脂經提取后，能夠促進補骨脂素、異補骨脂素的吸收，縮短達峰時間，更有利于有效成分的吸收和利用;從水提物和半仿生提取物測定結果來看，表明半仿生提取法更符合人體胃腸道吸收原理，模擬藥物口服后，經過的酸性、中性、堿性環(huán)境，使其有效成分在提取的過程中，轉化成易吸收的形式存在。從AUC和Cmax結果比較，超微粉組＞常規(guī)粉末組＞半仿生提取物＞水提取物，表明超微粉組的生物利用度最好，Cmax也最大，在相同生藥量給藥的條件下，均優(yōu)于半仿生提取物組和水提取物組，含量測定表明超微粉中補骨脂素和異補骨脂素總量均小于其他組，可以得出，超微粉碎技術在實現(xiàn)藥材細胞級破壁微粉碎的同時，使其細胞內的有效成分暴露出來，藥物的釋放速度及釋放量增加，大幅度提高了藥效成分的利用率;同時，藥材經超微粉碎后，很多有助于被測成分吸收的成分也被釋放出來。綜上所述，從藥物在體內的吸收利用程度考慮，利用藥代動力學特征評價提取工藝的好壞，更能有利于優(yōu)選最佳提取工藝，本實驗結果表明，藥材經提取后，并沒有提高主成分的吸收率，可能是煎煮過程中，破壞了能夠促進主成分吸收的成分;超微粉碎后的藥材粉末更有利于大鼠吸收，關于補骨脂不同工藝產物在大鼠體內代謝情況將進一步研究探討。

［1］王宇卿，閆明，陳 文，等.均勻設計優(yōu)選補骨脂半仿生提取法工藝條件［J］.石河子大學學報，2007，25(6):680 －3.

［1］Wang Y Q，Yan M，Chen W，et al.Technical condition of semibionic extraction in optimizing formula of fructus psoraleae through uniform design［J］.J Shihezi Univ(Natural Science)，2007，6(25):680－3.

［2］王宇卿，閆 明，陳 文，楊媛媛.補骨脂血清藥物化學的初步研究［J］.中國新藥雜志，2008，17(5):396 －9.

［2］Wang Y Q，Yan M，Chen W，Yang Y Y.Pilot study on serum pharmacochemistry of fructus psoraleae［J］.Chin J New Drugs，2008，17(5):396－9.

［3］馬晶晶，李金恒，曹曉梅，等.CYP2C19基因多態(tài)性對奧美拉唑藥動學與相對生物利用度的影響［J］.中國藥理學通報，2010，26(2):258－62.

［3］Ma J J，Li J H，Cao X M，et al.Effect of CYP2C19 polymorphism on pharmacokinetic profile and comparative bioavailability of omeprazole［J］.Chin Pharmaco Bull，2010，26(2):258 －62.

［4］李富榮，郭躍華，周漢新，齊 暉.卡鉑碳包鐵納米籠殼聚糖微球在大鼠體內的分布和藥代動力學研究［J］.中國藥理學通報，2009，25(6):809 －13.

［4］Li F R，Guo Y H，Zhou H X，Qi H.Studies on pharmacokinetics and tissue distribution of C-Fe@C-CN in rat［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(6):809 －13.

［5］劉大偉，武文斌.淺談中藥超微粉碎技術的現(xiàn)狀［J］.黑龍江醫(yī)藥，2010，5(23):763 －5.

［5］Liu D W，Wu W B.Ultrafine grinding technology of traditional Chinese medicine research and development［J］.Heilongjiang Med J，2010，5(23):763 －5.

［6］Wang X J，Sun H，F(xiàn)an Y L.Analysis and bioactive evaluation of the compounds absorbed into blood after oral administration of the extracts of vaccinium vitis-idaea in rat［J］.Biol Pharm Bull，2005，28(6):1106.