趙松峰，闞全程

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南鄭州 450052)

肝纖維化是多種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的中間病理階段，是威脅人類健康的常見疾病，也是原發(fā)性肝癌發(fā)病的危險(xiǎn)因素之一［1］。慢性肝病大多數(shù)都有肝纖維化，其中25%～40%最終發(fā)展成肝硬化甚至肝癌［2］。六味五靈片(Liuweiwulingpian)由五味子、女貞子、連翹、莪術(shù)、苣荬菜、靈芝孢子粉等中藥組成，現(xiàn)代藥理研究表明，五味子對(duì)慢性肝損傷大鼠有保肝降酶作用;女貞子、連翹、苣荬菜有保肝、利濕解毒作用;靈芝孢子粉能增強(qiáng)機(jī)體免疫力;莪術(shù)清瘀熱并可改善肝臟微循環(huán)［3］。六味五靈片在治療慢性肝損傷、乙肝、酒精性肝炎、肝硬化等方面均具有較好的臨床療效［3－5］，但是國(guó)內(nèi)外關(guān)于其基礎(chǔ)研究未見報(bào)道，因此本研究采用四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，觀察六味五靈片對(duì)肝纖維化的防治作用，并初步探討其作用機(jī)制，為六味五靈片的臨床應(yīng)用起到了指導(dǎo)性作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠(SPF級(jí))，♂，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在恒溫(21～24)℃，相對(duì)濕度45% ～50%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2試劑CCl4(天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，分析純)，六味五靈片(0.5 g/片，山東世博金都藥業(yè)有限公司，批號(hào):20101010)，復(fù)方鱉甲軟肝片(Fufangbiejiaruanganpian，0.5 g/片，內(nèi)蒙古福瑞中蒙藥科技有限公司，批號(hào):20100913)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)測(cè)定試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)測(cè)定試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，透明質(zhì)酸(hexadecenoic acid，HA)酶聯(lián)免疫分析試劑盒、層粘連蛋白(laminin，LN)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(上海西唐科技有限公司)，羥脯氨酸(hydroxyproline，HyP)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(美國(guó)R＆D公司)1.1.3儀器與設(shè)備Sartorius BP 211 D型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);SK 5200 HP型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲有限公司);QL-861型漩渦混勻器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司);TG16-WS高速離心機(jī)(南賽特儀器廠);Therrno 3001 Varioskan Flash全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀(北京平利洋醫(yī)療設(shè)備有限公司);AU-2700型全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus公司);UV-2409型紫外分光光度計(jì)，Olympus BX-50型顯微鏡，DZKW型電熱恒溫水浴鍋(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);DQP-9010石蠟冷凍切片機(jī)(上海華巖儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1建立大鼠肝纖維化模型Wistar大鼠90只，體質(zhì)量180～220 g。隨機(jī)各選取24只分別作為空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組，每組12只?？瞻讓?duì)照組不做任何處理，自由飲食、飲水;溶劑對(duì)照組腹腔注射1 ml·kg－1植物油溶液，每周2次，共4周;其余大鼠均腹腔注射1 ml·kg－140%的CCl4－植物油溶液，每周2次，共4周，構(gòu)建肝纖維化模型。建立大鼠肝纖維化模型過程中，死亡4只，于末次注射后禁食不禁水20 h，眼靜脈叢取血，檢測(cè)血清中ALT、AST含量，60只大鼠血清中ALT、AST與空白對(duì)照組對(duì)比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明60只大鼠肝纖維化模型復(fù)制成功。見Tab 1。

Tab 1 Serum ALT and AST in hepatic fibrosis rats(±s)

Tab 1 Serum ALT and AST in hepatic fibrosis rats(±s)

#P＜0.05 vs control group

Group ALT/IU·L－1 AST/IU·L －1 Control 46.32 ±10.23 48.29 ±9.88 Solvent 47.98 ±7.89 52.23 ±6.79 Model 253.81 ±59.07# 238.12 ±68.12#

1.2.2動(dòng)物分組及處理將復(fù)制CCl4肝纖維化模型而存活的60只大鼠，隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為模型組、陽(yáng)性對(duì)照藥復(fù)方鱉甲軟肝片組(750 mg·kg－1)、六味五靈片低劑量組(4 g·kg－1)、六味五靈片中劑量組(8 g·kg－1)、六味五靈片高劑量組(16 g·kg－1)。除空白對(duì)照組和溶劑對(duì)照組外，其余各組繼續(xù)腹腔注射1 ml·kg－140%的CCl4－植物油溶液，每周兩次。復(fù)方鱉甲軟肝片組及六味五靈片低劑量、中劑量、高劑量組每天1次灌胃給藥，共4周。所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)食料，自由飲水。

1.2.3主要觀察指標(biāo)于末次灌胃后禁食20 h，眼靜脈叢取血后斷頸處死，取血清于－20℃保存，用于測(cè)定AST、ALT、HA、LN及HyP。另取肝臟右葉于體積分?jǐn)?shù)10%的甲醛溶液中固定，用于病理切片Masson染色的分析，其余肝臟于液氮中保存，進(jìn)行生化指標(biāo)GSH、SOD及MDA含量的測(cè)定。所有指標(biāo)測(cè)定均按試劑盒操作。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用±s表示，比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD法，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1六味五靈片對(duì)大鼠血清中AST、ALT的影響

溶劑對(duì)照組血清中AST、ALT與空白對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。模型組血清中AST、ALT較空白對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，六味五靈片低劑量組大鼠血清中AST和ALT降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);六味五靈片中、高劑量組大鼠血清中AST和ALT降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。這提示中劑量和高劑量六味五靈片均可明顯降低由CCl4造成的大鼠血清中AST和ALT的升高。見Tab 2。

Tab 2 Effect of Liuweiwuling on serum ALT and AST in rats(±s，n=12)

Tab 2 Effect of Liuweiwuling on serum ALT and AST in rats(±s，n=12)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs model

Group Dose/g·kg－1 ALT/IU·L－1 AST/IU·L －1 Control － 47.23 ±21.32 45.39 ±3.98 Solvent － 52.24 ±17.81 55.54 ±7.99 Model － 248.71 ±46.42# 209.93 ±18.16#Fufangbiejiaruanganpian 0.75 92.49 ±30.73* 89.33 ±19.51*Low dose liuweiwulingpian 4 190.66 ±43.77 185.36 ±9.74 Middle dose liuweiwulingpian 8 125.73 ±25.30* 141.61 ±6.72*High dose liuweiwulingpian 16 99.76 ±13.64* 97.37 ±6.67*

2.2六味五靈片對(duì)大鼠血清HA、LN和Hyp的影響溶劑組大鼠血清HA，LN和HyP含量與空白對(duì)照組對(duì)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);模型組大鼠血清HA，LN和HyP含量與空白組對(duì)比差異有顯著性(P＜0.05);與模型組相比，六味五靈片中、高劑量組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果提示，中劑量和高劑量六味五靈片能夠明顯降低由CCl4造成的大鼠血清HA，LN和HyP含量升高。見Tab 3。

Tab 3 Effect of Liuweiwuling on serum HA，LN and HyP in rats(±s，n=12)

Tab 3 Effect of Liuweiwuling on serum HA，LN and HyP in rats(±s，n=12)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs model

Group Dose/g·kg－1 HA/μg·L－1 LN/μg·L－1 HyP/μg·L －1 Control － 149.46 ±21.62 85.39 ±3.98 16.38 ±0.30 Solvent － 151.24 ±37.81 85.54 ±3.99 16.78 ±0.48 Model － 368.71 ±38.42# 127.93 ±18.16# 23.13 ±0.58#Fufangbiejiaruanganpian 0.75 292.49 ±33.45* 89.75 ±9.51* 18.84 ±0.90*Low dose liuweiwulingpian 4 342.74 ±52.73 125.32 ±19.24 22.14 ±0.16 Middle dose liuweiwulingpian 8 269.32 ±35.43* 101.43 ±16.24* 19.98 ±0.38*High dose liuweiwulingpian 16 199.75 ±31.56* 93.37 ±12.33* 18.46 ±0.97*

Tab 4 Effect of Liuweiwuling on GSH，MDA and SOD in rats(±s，n=12)

Tab 4 Effect of Liuweiwuling on GSH，MDA and SOD in rats(±s，n=12)

#P＜0.05 vs control;*P＜0.05 vs model

Group Dose/g·kg－1 GSH/mg·g－1Pro MDA/nmol·g－1Pro SOD/U·g－1Pro Control － 3.01 ±0.24 1.43 ±0.32 278.54 ±28.70 Solvent － 2.92 ±0.46 1.32 ±0.35 272.08 ±19.73 Model － 1.87 ±0.26# 3.00 ±0.45# 165.75 ±12.65#Fufangbiejiaruanganpian 0.75 2.66 ±0.47* 2.37 ±0.52* 157.65 ±17.44 Low dose liuweiwulingpian 4 1.96 ±0.57 2.73 ±0.43 170.85 ±25.37 Middle dose liuweiwulingpian 8 2.14 ±0.23* 2.13 ±0.28* 211.31 ±39.41*High dose liuweiwulingpian 16 2.52 ±0.42* 1.69 ±0.70* 241.21 ±38.40*

Fig 1 The Masson trichrome examinations of the liver sections in rats(×200)

2.3六味五靈片對(duì)肝纖維化大鼠肝組織中GSH、MDA和SOD的影響溶劑對(duì)照組大鼠肝組織中GSH、MDA和SOD的含量與空白對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中GSH和SOD降低，MDA升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組相比，六味五靈片中、高劑量組大鼠血清GSH和SOD含量升高，而 MDA降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見Tab 4。

2.4六味五靈片對(duì)肝纖維化大鼠組織病變的影響

Masson染色結(jié)果顯示，空白對(duì)照組肝組織染色顯示小葉間和匯管區(qū)基本無膠原纖維分布，中央靜脈及肝竇內(nèi)有輕微的膠原纖維分布，在偏光顯微鏡下基本不見紅黃及綠色的膠原纖維，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，未見纖維增生。模型組Masson染色下可見匯管區(qū)和小葉間有大量粗大增生的膠原纖維，肝小葉被重新分割，組織切片中有大量假小葉形成，膠原纖維呈寬帶狀，互相連接，細(xì)胞變性壞死明顯。偏光顯微鏡下區(qū)分可見紅、黃色成分居多。六味五靈片高劑量組肝組織膠原纖維明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)也有所恢復(fù)，仍有部分點(diǎn)狀細(xì)胞壞死。六味五靈片中劑量組肝組織膠原纖維明顯減少，肝小葉結(jié)構(gòu)也有所恢復(fù)，細(xì)胞壞死明顯。

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同途徑。肝纖維化的實(shí)質(zhì)是由于膠原和其它細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成與降解失衡，導(dǎo)致ECM在肝內(nèi)過量沉積。參與肝纖維化形成的ECM成分包括膠原蛋白、非膠原性糖蛋白和蛋白多糖3大類［6］。HA是構(gòu)成ECM中蛋白多糖的主要成分，LN是一種重要的結(jié)構(gòu)糖蛋白，HA和LN對(duì)慢性肝損傷和肝纖維化的診斷價(jià)值已得到普遍承認(rèn)［7］。膠原纖維主要由膠原蛋白所構(gòu)成，HyP為膠原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝臟中的含量可反映膠原代謝的變化情況，與肝纖維化程度相平行。其對(duì)肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展起重要作用［8－9］。

在慢性炎癥、機(jī)化和瘢痕形成中，可隨病理過程的發(fā)展而出現(xiàn)膠原纖維。在早期，HE染色切片中的這些纖維往往和纖維蛋白很難鑒別，通過膠原纖維染色則可證實(shí)，因此本實(shí)驗(yàn)采用Masson染色觀察肝組織的纖維化病變。

本研究表明，六味五靈片可以明顯降低由CCl4所致的大鼠血清中AST、ALT的升高，說明六味五靈片具有抑制肝損傷的作用;六味五靈片還可以降低血清中升高的HA、LN和HyP含量。Masson染色提示其可以抑制纖維增生，說明六味五靈片可以抑制肝臟膠原纖維的合成和沉積，具有抗肝纖維化作用;此外，六味五靈片還可明顯升高損傷肝組織的GSH和SOD含量，降低MDA的含量，說明六味五靈片具有抗氧化作用，這些作用可能與六味五靈片抗肝纖維化機(jī)制有關(guān)。六味五靈片的具體臨床療效還需要更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

［1］Friedman S L.Molecular regulation of hepatic fibrosis，an integrated cellular response to tissue injury［J］.J Biol Chem，2000，275(4):2247－50.

［2］Pinzani M，Romanelli R G，Magli S.Progression of fibrosis in chronic liver diseases:time to tally the score［J］.J Hepatol，2001，34(5):764－7.

［3］韓 軍，蘇淑慧，王春平，等.六味五靈片治療慢性肝損傷的臨床研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2007，17(5):266 －7.

［3］Han J，Su S H，Wang C P，et al.The clinical study of Liuwei Wuling tablet on chronic hepatitis B with chronic liver damage［J］.Chin J Integr Trad West Med Liver Dis，2007，17(5):266 －7.

［4］辛紹杰，韓 晉，丁晉彪，等.六味五靈片治療慢性乙型肝炎多中心隨機(jī)對(duì)照研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2009，19(1):7－9.

［4］Xin S J，Han J，Ding J B，et al.The clinical study of Liuweiwuling tablet on patients with chronic hepatitis B［J］.Chin J Integr Trad West Med Liver Dis，2009，19(1):7 －9.

［5］榮義輝，董 政，朱 冰，等.六味五靈片治療酒精性肝炎的療效觀察［J］.傳染病信息，2009，22(2):107 －9.

［5］Rong Y H，Dong Z，Zhu B，et al.Therapeutic effect of Liuweiwuling tablet on alcoholic steatohepatitis［J］.Infect Dis Inf，2009，22(2):107－9.

［6］黃 艷，黃 成，李 俊.肝纖維化病程中Kupffer細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)肝星狀細(xì)胞活化增殖、凋亡的調(diào)控［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(1):9 －13.

［6］Huang Y，Huang C，Li J.Effect of cytokines secreted from Kupffer cell on HSC proliferation，apoptosis in hepatic fibrosis process［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(1):9 －13.

［7］Plebai M，Burlina A.Biochemical marker of fibrosis［J］.Clin Bioehem，1991，24(3):219 －39.

［8］李異玲，王天驕，傅寶玉.一氧化氮在化學(xué)性肝纖維化中作用的探討［J］.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，29(1):51 －2.

［8］Li Y L，Wang T J，F(xiàn)u B Y.Study on nitric oxide in experimental chemical hepatic fibrosis［J］.J Chin Med Univ，2000，29(1):51－2.

［9］孫嫵弋，魏 偉，桂雙英，等.芍芪多苷抗大鼠免疫性肝纖維化作用及部分機(jī)制［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26(4):492 －7.

［9］Sun W Y，Wei W，Gui S Y，et al.Effects and mechanisms of Shaoqiduogan on immunological hepatic fibrosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):492 － 7.