韓潞潞，趙華平，薛慶生，于布為

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院麻醉科，上海 200025)

大鼠切口痛模型與臨床術(shù)后疼痛極為相似［1］，且不同于炎性疼痛模型［2］和神經(jīng)病理性痛模型［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，碳酸酐酶抑制劑乙酰唑胺(ACT)可以緩解炎性痛［4］和神經(jīng)病理性痛［5］。ACT 能否減輕切口痛尚待研究證實。本研究應(yīng)用切口痛模型，觀察術(shù)后鞘內(nèi)使用碳酸酐酶抑制劑ACT對切口痛大鼠熱痛覺過敏和機械痛覺過敏的影響，并探討其相關(guān)作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物溶劑及儀器試劑♂ Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量250～300 g，由中科院上海實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(滬)2007-0005。ACT從Sigma-Aldrich公司購買(貨號:A6011)，使用前用生理鹽水溶解。Von Frey細(xì)絲購自美國Stoelting公司;熱痛刺激儀BME-410C，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所生產(chǎn)。

1.2動物分組及給藥將大鼠隨機分為5組，每組16只。假手術(shù)組(Sham組)、ACT注射對照組(Sham+A組)、切口模型組(Incision組)、切口模型+ACT低劑量組(Incision+LA組)、切口模型+ACT高劑量組(Incision+HA組)。Sham組和Incision組鞘內(nèi)注射10 μl生理鹽水，Sham+A組和Incision+HA 組鞘內(nèi)注射 ACT(10 μl，2.25 g·L－1)，Incision+LA 組鞘內(nèi)注射 AC(10 μl，0.225 g·L－1)。ACT和生理鹽水均在切口痛手術(shù)后d1給予，ACT 的劑量參考相關(guān)文獻［4－5］。

1.3鞘內(nèi)置管模型的建立大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg·kg－1麻醉后，按改良的Yaksh 法［6］于大鼠背部L3－L4間隙作長約2 cm的皮膚縱切口，切開筋膜，分離肌肉，顯示L3及L4棘突間隙，再以25 G針穿破黃韌帶及硬脊膜，可見清亮的腦脊液外溢，經(jīng)硬脊膜破口插入PE-10導(dǎo)管約2 cm，開口端位于L1-L2，固定導(dǎo)管，予生理鹽水20 μl沖洗導(dǎo)管。經(jīng)皮下隧道將導(dǎo)管的另一端引出于頸部，外露2 cm固定，并用高溫封閉導(dǎo)管外口，以防腦脊液外溢。術(shù)后肌注青霉素30 000 U，并單籠飼養(yǎng)。置管后d 3，鞘內(nèi)注射利多卡因(10 μl，20 g·L－1)，30 s 內(nèi)出現(xiàn)雙后肢不能負(fù)重、拖地及針刺下肢無回縮反應(yīng)者表示置管成功。本實驗動物鞘內(nèi)置管均成功。

1.4切口痛模型的建立按照Brennan法［1］建立切口痛模型。在七氟醚麻醉下，消毒大鼠左后爪，鋪洞巾后，從足底近端0.5 cm處向趾部作長約1 cm的切口，切開皮膚后，用眼科鑷挑起足底肌肉并縱向切割，保持肌肉的起止及附著完整。該切口貫穿后足皮膚、筋膜和跖肌。按壓止血，用5-0尼龍細(xì)線縫合皮膚共2針。整個手術(shù)過程約為5 min。術(shù)后皮下注射青霉素30 000單位，置于溫暖、安靜、避光的環(huán)境中。

1.5測量大鼠熱縮足潛伏期于術(shù)前d 1、術(shù)后d 1(給藥前，給藥后 30、75、120、165、240 min)各時間點對各大鼠(每組8只)進行熱痛行為檢測。具體方法:動物置于底部為玻璃平板(厚度2 mm)的塑料方盒中適應(yīng)30 min。用熱輻射法［7］，即以熱痛刺激儀照射足底切口附近5 mm區(qū)域，記錄自照射起至后爪回縮的時間(s)，取3次的平均值為其熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。單次照射時間不超過25 s，以免損傷照射部位。

1.6測量大鼠機械縮足反射閾值于術(shù)前d 1、術(shù)后d 1(給藥前，給藥后 30、75、120、165、240 min)各時間點對各大鼠(每組8只)進行機械痛行為檢測。具體過程:將大鼠置于架空的塑料方盒中，方盒底部為鋼網(wǎng)，大鼠在其中可以自由活動，適應(yīng)30 min后，用von Fray探針給予足底切口附近5 mm區(qū)域機械性刺激，持續(xù)1.5 s，每隔30 s以上刺激1次。連續(xù)刺激10次，大于5次后爪回縮者(50%縮足反射閾值)，認(rèn)為大鼠對該力度的刺激有縮足反應(yīng)［8］。從小至大選用不同力度von Fray探針刺激足底，記錄能引起大鼠縮足反應(yīng)的探針刻度(g)，即為機械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。如果刺激強度達(dá)到26 g，大鼠仍沒有反應(yīng)則計為26 g。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以±s表示，應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件，TWL采用重復(fù)測量資料的方差分析，MWT采用非參數(shù)檢驗進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1鞘內(nèi)注射ACT對大鼠TWL及MWT的影響

在各時間點，Sham+A組與Sham組相比TWL及MWT均無差別(P＞0.05);Sham+A組與自身給藥前相比在各時間點TWL及MWT均無改變(P＞0.05)，見 Tab 1。

2.2鞘內(nèi)注射ACT對Incision大鼠TWL及MWT的影響Incision組、Incision+LA組、Incision+HA組切口術(shù)后d1給藥前(Pre)與自身基礎(chǔ)值(Base)相比TWL及MWT均明顯降低(P＜0.05)。Incision+HA組，與自身給藥前相比，給藥后30、75、120 min TWL明顯升高(P＜0.05)，但MWT無改變(P＞0.05)。與Incision組相比，Incision+HA組給藥后30、75、120 min TWL 明顯增高(P＜0.05)，但MWT無差別(P＞0.05)。Incision+LA組與Incision組在各個時間點TWL及MWT均無差異(P＞0.05)。見Tab 2。

Tab 1 Effect of intrathecal administration of ACT on TWL and MWT in rats(±s，n=8)

Tab 1 Effect of intrathecal administration of ACT on TWL and MWT in rats(±s，n=8)

Group Base Pre 30 min 75 min 120 min 165 min 240 min TWL/s Sham 10.45 ±0.97 10.42 ±0.88 10.67 ±1.45 10.03 ±1.10 9.91 ±0.70 9.79 ±0.62 10.00 ±1.08 Sham+A 10.21 ±1.13 10.19 ±0.69 10.98 ±1.20 10.46 ±1.44 10.10 ±1.27 10.06 ±0.87 10.04 ±1.53 MWT/g Sham 23.25 ±5.09 23.25 ±5.09 22.63 ±6.39 23.25 ±5.09 21.88 ±5.69 21.88 ±5.69 22.63 ±6.39 Sham+A 21.88 ±5.69 22.63 ±6.39 23.25 ±5.09 22.63 ±6.39 23.25 ±5.09 23.25 ±5.09 23.25 ±5.09

Tab 2 Effect of intrathecal administration of ACT on TWL and MWT in incision rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of intrathecal administration of ACT on TWL and MWT in incision rats(±s，n=8)

*P＜0.05 vs incision group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs pre

Group Base Pre 30 min 75 min 120 min 165 min 240 min TWL/s Incision 10.34 ±1.55## 5.45 ±0.97 5.85 ±0.98 5.93 ±0.95 6.01 ±1.07 5.80 ±1.11 5.42 ±0.84 Incision+LA 10.29 ±1.01## 5.67 ±1.10 6.27 ±1.17 6.22 ±1.18 5.82 ±1.23 5.88 ±1.09 5.76 ±1.25 Incision+HA 10.17 ±0.96## 5.59 ±1.32 7.93 ±1.22*# 8.13 ±188*# 7.79 ±1.46*## 7.04 ±1.37 6.33 ±1.22 MWT/g Incision 23.25 ±5.09# 6.75 ±2.12 7.25 ±1.49 7.25 ±1.83 7.25 ±1.04 6.75 ±1.49 7.50 ±1.41 Incision+LA 21.88 ±5.69# 7.00 ±1.85 7.25 ±1.83 6.75 ±1.83 6.50 ±1.41 7.63 ±3.11 6.50 ±2.07 Incision+HA 23.25 ±5.09# 6.50 ±1.41 7.75 ±2.49 6.25 ±1.67 6.00 ±1.85 6.88 ±3.36 6.38 ±3.78

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)切口術(shù)后d 1，大鼠TWL及MWT都明顯降低，說明大鼠出現(xiàn)了明顯的痛覺過敏現(xiàn)象。假手術(shù)組大鼠鞘內(nèi)注射較高劑量ACT后，TWL及MWT都沒有變化，提示鞘內(nèi)注射ACT對正常大鼠不具有鎮(zhèn)痛作用。在大鼠切口痛模型中術(shù)后鞘內(nèi)給予較高劑量的碳酸酐酶抑制劑ACT后TWL增加，證實ACT可以緩解熱痛覺過敏，并且具有一定的劑量依賴性。

先前臨床研究［9］表明，術(shù)中靜脈使用ACT可以緩解二氧化碳?xì)飧垢骨荤R手術(shù)術(shù)后牽涉痛，但對切口痛沒有影響。本研究結(jié)果與其不一致的原因，除了給藥方式不同外，可能是由于其采用了更多依賴于主觀的視覺模擬評分對人類自發(fā)痛進行評估，而本研究則采用了較客觀的工具對大鼠誘發(fā)痛進行測量。在動物實驗中，Radhakrishnan等［4］在角叉菜膠注射到大鼠腓腸肌模型中發(fā)現(xiàn)ACT可以削弱炎性痛，Asiedu等［5］在神經(jīng)根結(jié)扎模型中發(fā)現(xiàn)ACT可以抑制神經(jīng)病理性痛，并且都呈現(xiàn)劑量依賴性，本研究結(jié)果與其一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射碳酸酐酶抑制劑ACT后MWT沒有變化，說明ACT對機械痛覺過敏沒有影響。在炎性痛模型［4］及神經(jīng)病理性痛模型［10］也有類似的結(jié)果。這可能是由于熱痛敏和機械痛敏的發(fā)展過程可能不同，從而使某些藥物對熱痛敏和機械痛敏的效應(yīng)不同。

鞘內(nèi)注射碳酸酐酶抑制劑緩解切口痛術(shù)后熱痛敏，可能是通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)γ氨基丁酸(GABA)能抑制性突觸傳遞而發(fā)揮作用的。正常情況下，中樞神經(jīng)系統(tǒng)GABA受體負(fù)責(zé)把胞外Cl－轉(zhuǎn)入胞內(nèi)發(fā)揮快速的超極化抑制作用;但在某些病理狀態(tài)下，HC流出取代正常時Cl－的流入，可以使GABA受體由抑制轉(zhuǎn)成興奮［11］，使突觸后細(xì)胞產(chǎn)生去極化，突觸可塑性改變，從而導(dǎo)致了痛覺過敏的發(fā)生。先前有研究［12］發(fā)現(xiàn)，作用于GABA受體的藥物(戊巴比妥和咪達(dá)唑侖)可以使TWL降低，鞘內(nèi)使用碳酸酐酶抑制劑可以緩解這一作用。這說明碳酸酐酶抑制劑在中樞可能通過抑制二氧化碳水化，使HC產(chǎn)生減少，降低GABA受體的興奮性，從而緩解切口模型引起的大鼠痛覺過敏現(xiàn)象。正常大鼠GABA受體本身為抑制狀態(tài)，很少有HCO3－通過GABA受體流出胞外，所以ACT不能提高正常大鼠的痛閾。

術(shù)后疼痛常引起自發(fā)痛，觸誘發(fā)痛及痛覺過敏，給患者帶來極大的痛苦甚至影響其預(yù)后。由Brennan等［1］提出的大鼠切口痛模型與臨床術(shù)后疼痛極為相似，損傷涉及皮膚、筋膜和肌肉，術(shù)后可以用von Frey纖毛測量其MWT，熱輻射儀測量其TWL，可較客觀地評價藥物的鎮(zhèn)痛作用。目前雖然在炎性痛模型［4］和神經(jīng)病理性痛模型［5］有了許多新發(fā)現(xiàn)，但這些模型與臨床術(shù)后疼痛相似性不及切口痛模型。因此將切口痛作為一類特殊的疼痛加以深入研究，對術(shù)后疼痛的治療十分必要。

總之，鞘內(nèi)給予碳酸酐酶抑制劑ACT可緩解切口模型大鼠的熱痛覺過敏，碳酸酐酶在中樞可能參與了切口痛的熱痛敏過程，其機制還有待進一步研究。

［1］Brennan T J，Vandermeulen E P，Gebhart G F.Characterization of a rat model of incisional pain［J］.Pain，1996，64(3):493 －501.

［2］吉小莉，顏玲娣，周培嵐，等.芋螺毒素ω-SO3單次及連續(xù)給藥對福爾馬林致大鼠炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(4):476－82.

［2］Ji X L，Yan L D，Zhou P L，et al.Antinociception of omega-conotox in ω-SO3 in rat formalin test after acute or chronic intrathecal administration［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26(4):476 － 82.

［3］毛慶祥.楊天德.阿米替林對神經(jīng)病理性疼痛大鼠脊髓GLAST的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2009，25(3):390 －3.

［3］Mao Q X，Yang T D.Influence of amitriptyline on GLAST in spinal cord of rat in neuropathic pain［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(3):390－3.

［4］Radhakrishnan R，Sluka K A.Acetazolamide，a carbonic anhydrase inhibitor，reverses inflammation-induced thermal hyperalgesia in rats［J］.J Pharmacol Exp Ther，2005，313(2):921 －7.

［5］Asiedu M，Ossipov M H，Kaila K，et al.Acetazolamide and midazolam act synergistically to inhibit neuropathic pain［J］.Pain，2010，148(2):302 －8.

［6］Storkson R V，Kjorsvik A，Tjolsen A，et al.Lumbar catheterization of the spinal subarachnoid space in the rat［J］.J Neurosci Meth-ods，1996，65(2):167 －72.

［7］Wang Y X，Pettus M，Gao D，et al.Effects of intrathecal administration of ziconotide，a selective neuronal N-type calcium channel blocker，on mechanical allodynia and heat hyperalgesia in a rat model of postoperative pain［J］.Pain，2000，84(2 －3):151 －8.

［8］Chaplan S R，Bach F W，Pogrel J W，et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw［J］.J Neurosci Methods，1994，53(1):55－63.

［9］Woehlck H J，Otterson M，Yun H，et al.Acetazolamide reduces referred postoperative pain after laparoscopic surgery with carbon dioxide insufflation［J］.Anesthesiology，2003，99(4):924 － 8.

［10］聶 鑫，朱珊珊，曾因明.γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運體抑制劑NO-711術(shù)前鞘內(nèi)注射對坐骨神經(jīng)慢性擠壓傷大鼠神經(jīng)病理性痛覺過敏的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(7):895－6.

［10］Nie X，Zhu S S，Zeng Y M.Effects of preemptive intrathecal administration of γ-aminobutyric acid transporters-1 inhibitor NO-711 on neuropathic pain induced by chronic constriction injury in rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(7):895 －6.

［11］Rivera C，Voipio J，Kaila K.Two developmental switches in GABAergic signalling:the K+-Cl－cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII［J］.J Physiol，2005，562(Pt 1):27 －36.

［12］Wang B，Samanani N，Roth S H，et al.Spinal carbonic anhydrase contributes to nociceptive reflex enhancement by midazolam，pentobarbital，and propofol［J］.Anesthesiology，2003，98(4):921 －7.