丁 鴻，邱東萍，游柏壽

（1.揭陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣東 揭陽 522000；2.彭澤縣人民醫(yī)院，江西 彭澤 332700）

潮陽草雞是潮汕地區(qū)的一種優(yōu)良雞種，善覓食，抗病力強(qiáng)，成活率高。屬瘦肉型，皮薄肉嫩，味道鮮美，香脆滑潤(rùn)，適宜白切、清燉、鹽焗等，是傳統(tǒng)的宴客佳肴。本實(shí)驗(yàn)以潮陽草雞胚胎組織為材料，進(jìn)行體外成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，旨在為潮陽草雞的育種提供細(xì)胞學(xué)方面的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 潮陽草雞孵化蛋30枚，9～13日齡，購(gòu)自汕頭市白沙禽畜原種研究所種雞場(chǎng)。

1.1.2 供試試劑 MEM(含Earle′s鹽)培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco，胰蛋白酶（Trypsin 1：250）購(gòu)自 Amresco，標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Standard FBS）購(gòu)自Hyclone，臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自Sigma，青霉素、鏈霉素為國(guó)產(chǎn)。全培養(yǎng)基：MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清+100 IU/mL雙抗。

1.2 方 法[1-3]

1.2.1 原代培養(yǎng) 超凈工作臺(tái)內(nèi)取雞胚腿部肌肉組織置于小培養(yǎng)皿內(nèi)，用1×PBS+1%雙抗漂洗4～5次，用眼科剪剪成1mm3左右大小，移入培養(yǎng)瓶壁，均勻分散，加入全培養(yǎng)液，倒置培養(yǎng)瓶，置CO2培養(yǎng)箱中（37.5℃，5%CO2），過夜。當(dāng)組織塊貼壁牢固時(shí)，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，不浸潤(rùn)組織塊。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)出后，及時(shí)更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 傳代培養(yǎng) 當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合時(shí)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。去舊培養(yǎng)液，加入預(yù)熱至37℃，0.75%的 NaCl溶液，清洗細(xì)胞 2～3次，然后加入0.25%的胰酶液，消化10～30 s，倒置顯微鏡下觀察。當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，細(xì)胞間隙增大時(shí)，立即加入全培養(yǎng)液，細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，按1∶2或1∶3的比例分瓶，放入溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞冷凍保存 將處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的細(xì)胞于24 h前更換新鮮全培養(yǎng)基。常規(guī)方法消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。1 000 r/min離心8min，收集細(xì)胞。視細(xì)胞數(shù)量多少加入凍存液（10%DMSO+90%FBS），調(diào)細(xì)胞密度到（3～5）×106mL，分裝入無菌塑料凍存管中，每支1 mL。將凍存管裝入裝有異丙醇的冷凍盒，-70℃冰箱過夜。次日提出安瓿，放入液氮罐中保存。

1.2.4 冷凍細(xì)胞復(fù)蘇 從液氮罐中小心取出凍存管，迅速浸沒在37～40℃的溫水中并快速晃動(dòng)，使細(xì)胞液在1～2min內(nèi)完全融解。吸出細(xì)胞懸液，加入到裝有全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。置于37.5℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)性狀檢測(cè)

1.3.1 細(xì)胞一般形態(tài)學(xué)觀察 在培養(yǎng)過程中，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、培養(yǎng)液的pH值改變以及細(xì)胞是否污染等。并作好記錄，用相差顯微鏡拍照。

1.3.2 制作細(xì)胞生長(zhǎng)曲線[4]取生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，常規(guī)方法消化制成細(xì)胞懸液，按（1～5）×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度在24孔培養(yǎng)板中接種等量細(xì)胞。共設(shè)7組，每組3孔，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從次日起，即開始計(jì)算第一組每孔中的細(xì)胞數(shù)，取3孔的平均值，如此至第7組結(jié)束。用Origin 6.1軟件繪成細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。

1.3.3 細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞存活率 細(xì)胞冷凍前和細(xì)胞復(fù)蘇后，采用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)算細(xì)胞存活率。在Trypan染液中，健康活細(xì)胞胞體完整，細(xì)胞透明不著色，呈藍(lán)色者均為死細(xì)胞。計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)

如圖1、圖2所示，組織塊貼附1～2 d后便可見細(xì)胞從組織塊周圍游出生長(zhǎng)，典型的成纖維樣，隨后迅速向外擴(kuò)散，呈明顯的火焰狀或放射狀走形。2～3 d后便可鋪滿瓶底，消化傳代。消化傳代后，細(xì)胞30 min便開始部分貼壁。2～3 d便可長(zhǎng)滿瓶底，此時(shí)細(xì)胞多發(fā)生粘連生長(zhǎng)，呈網(wǎng)狀分布，細(xì)胞界線不甚清晰。長(zhǎng)滿后繼續(xù)消化傳代，如此直到冷凍保存。

圖1 潮陽草雞原代細(xì)胞

圖2 潮陽草雞傳代細(xì)胞

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

常規(guī)方法制備細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種24孔培養(yǎng)板，每孔1mL細(xì)胞懸液，2.0×105個(gè)細(xì)胞。連續(xù)7 d測(cè)得數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 潮陽草雞細(xì)胞培養(yǎng)7 d細(xì)胞平均數(shù)表

繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖，由圖3可以看出，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈“S”型，主要經(jīng)歷潛伏生長(zhǎng)期、指數(shù)生長(zhǎng)期、水平靜止期3個(gè)時(shí)期。細(xì)胞的群體倍增時(shí)間約為24 h。在培養(yǎng)后期，細(xì)胞產(chǎn)生接觸抑制和密度抑制，生長(zhǎng)緩慢或停止生長(zhǎng)。

圖3 潮陽草雞細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率

潮陽草雞胚胎成纖維細(xì)胞在凍存前和凍存后的平均存活率分別達(dá)到94.8%和90.2%，表明細(xì)胞在生長(zhǎng)時(shí)健康狀況良好，培養(yǎng)條件適宜；凍存后解凍則存活率有所下降，表明細(xì)胞在冷凍和復(fù)蘇時(shí)可能受到一定的損傷。但在復(fù)蘇后培養(yǎng)30～60min內(nèi)便可見有細(xì)胞貼壁，4～6 h完全貼壁，與細(xì)胞傳代后貼壁相比，復(fù)蘇后細(xì)胞貼壁鋪展時(shí)間明顯延長(zhǎng)，可達(dá)24～36 h，48 h后細(xì)胞基本長(zhǎng)滿瓶底，可傳代培養(yǎng)，傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)速度和凍存前基本一致。

3 小結(jié)與討論

本實(shí)驗(yàn)以潮汕地區(qū)地方優(yōu)質(zhì)雞種——潮陽草雞胚胎為材料，在體外成功培養(yǎng)了成纖維細(xì)胞，并進(jìn)行了傳代和冷凍保存，復(fù)蘇后細(xì)胞的存活率仍達(dá)到90%以上，為潮陽草雞的育種在細(xì)胞學(xué)方面提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也為學(xué)院的細(xì)胞培養(yǎng)工作搭建了技術(shù)平臺(tái)。

細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染[5-7]，污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底，由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染[8]。

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