高旭，周正，沈恩允，景曉娟，郭雷鳴，王仙斌，孫勁文，杜云峰

結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在國內(nèi)外有逐年上升的趨勢，其中我國死亡率達到 7.42/10萬[1]。盡管外科技術(shù)不斷提高，但根治術(shù)后 5年生存率仍徘徊在 50%左右，故多數(shù)學(xué)者主張綜合治療[2]。在生物治療領(lǐng)域，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體 TRAIL-R1（death receptor4，DR4）及TRAIL-R2（death receptor5，DR5）具有介導(dǎo)細胞凋亡的特性，TRAIL受體激動劑（包括 TRAIL 和激動型抗體）成為國際上研究新方向。本實驗室利用人源化抗人 DR5 激動型單克隆抗體 CTB006，結(jié)合臨床結(jié)直腸癌 Duke’s 臨床分期，分別選用SW1116（Duke’s A 期）、SW480（Duke’s B 期）、SW620（Duke’s C 期）和 Colo205（Duke’s D 期）結(jié)直腸癌細胞，研究 CTB006 對之誘導(dǎo)凋亡作用，同時觀察治療效果和受體表達有無相關(guān)性，并與化療藥物 5-氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)用，觀察有無協(xié)同殺傷作用，為CTB006 的臨床腫瘤治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗人 DR5 單克隆抗體 CTB006 由北京同為時代生物技術(shù)有限公司提供；不同分期結(jié)直腸癌細胞 SW1116、SW480、SW620、Colo205 和人胚肺成纖維細胞（HELF）購自美國模式菌種收藏中心（ATCC）；細胞培養(yǎng)材料、胎牛血清（FBS）購自美國 GIBCO 公司；ATPlite 檢測試劑盒購自美國PerkinElmer 公司（批號：0RD00694）；羊抗人IgG-RPE（批號：1031-09）、羊抗人 RPE（批號：A0808-PB59）為美國 Southern Biotech 公司產(chǎn)品；5-FU 為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號：090807）。BHP9504-2 型微孔板發(fā)光分析儀為北京濱松光子技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Cytomics? FC500 型流式細胞儀為美國 Beckman Coulter 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將 SW1116、SW480、SW620 和HELF 細胞培養(yǎng)于含 10%FBS、0.1%青霉素 + 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液；Colo205 細胞培養(yǎng)于含 10mmol/L HEPES緩沖液、1mmol/L 丙酮酸鈉、10%FBS、0.1%青霉素 + 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液。在 37℃，含 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2～5 d，用 0.25%胰酶消化，以 1∶1～1∶3傳代，收集對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的細胞進行實驗。

1.2.2 ATPlite 法檢測抗人 DR5 單抗 CTB006與 5-FU 合用對結(jié)直腸癌細胞系增殖的影響

1.2.2.1 實驗分組及劑量 把 SW1116、SW480、SW620、Colo205 分別設(shè) CTB006 組、CTB006 +5-FU 合用組和 5-FU 組。CTB006 組給予劑量分別為1.88、0.94、0.47、0.24、0.12 nmol/L，1 h后 CTB006 組和聯(lián)合用藥組加羊抗人 RPE 二抗；5-FU 組劑量分別為1600、800、400、200、100 μmol/L；CTB006 + 5-FU 合用組依照上述兩藥濃度梯度共同給藥。另設(shè) CTB006 和 5-FU 單用組用于評價 CTB006對 HELF 細胞的靶向治療作用。各組均設(shè)陰性對照[3]。

1.2.2.2 ATPlite 法檢測細胞存活率[4]用 0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含相應(yīng) DMEM 或 RPMI1640培養(yǎng)液配成 6×104個/L 單個細胞懸液，按每孔50 μl 接種于 96 孔板，CO2孵箱（37℃，5%CO2）內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后加上述各組藥物，每組 3 個復(fù)孔，每孔終體積為100 μl。48 h 后依照 ATPlite 試劑盒說明每孔加入 50 μl 細胞裂解液，震蕩 3min。吸取裂解上清 50 μl 于酶標板中，再加入 25 μl 發(fā)光液，震蕩 10 s 后，避光靜置 3min。將孵育好的酶標板放入發(fā)光儀，讀取發(fā)光值。使用 BHP9504微孔板發(fā)光分析儀 4.3.32 軟件進行數(shù)據(jù)處理。細胞存活率（survival rate）=（樣品發(fā)光值平均值/對照組發(fā)光值平均值）×100%。實驗重復(fù) 3 次，取平均值。

評價聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的抑制是否有協(xié)同作用，采用兩種藥物聯(lián)合作用系數(shù)（combination index，CI），CI = AB/(A×B)，根據(jù)活細胞數(shù)（發(fā)光度值）進行計算。AB 是兩藥聯(lián)合組與對照組的比值；A 和 B 是各藥單獨使用組與對照組的比值。如 CI＜1，證明兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同；如 CI = 1，則兩藥無相互作用；如 CI ＞ 1，則兩藥作用性質(zhì)為拮抗[5]。

1.2.3 流式細胞儀技術(shù)檢測結(jié)直腸癌細胞系表面DR5 表達 將消化好的結(jié)直腸癌細胞，用含 2%FBS 的 PBS 洗液 524×g離心 4min。細胞盡量要求為單個。計數(shù)后將細胞稀釋為2×106個/ml，加入 96 孔圓底板中，每孔 50 μl。將 CTB006 稀釋為15 nmol/L，取 50 μl 與細胞混合，使終濃度為7.5 nmol/L。冰上孵育 1 h。洗液洗 2 次，524×g離心，每次 4min。羊抗人 IgG-RPE 1∶250 稀釋，取 20 μl 加入各孔中，混勻細胞。同時設(shè)只加二抗的陰性對照。冰上孵育 15min。洗液 524×g洗2 次，每次 4min。每管加入 300 μl 洗液，4℃下放置，30min 內(nèi)上機檢測。用 WinMID 2.9 軟件分析結(jié)果，求出各株細胞表面 DR5與抗體結(jié)合率Gated%。實驗重復(fù) 3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用±s表示，比較采用方差分析（ANOVA），以P＜0.05 為存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 抗人 DR5 單抗 CTB006 的靶向治療作用

四株結(jié)直腸癌細胞及 HELF 均生長狀態(tài)良好。SW1116、SW480、SW620 為貼壁生長，Colo205為半懸浮生長。5-FU 對 HELF 細胞增殖抑制明顯，且呈劑量依賴，濃度為100 μmol/L 時細胞生存率為（89±1）%，400 μmol/L 時細胞生存率為（60±1.3）%，1600 μmol/L 時細胞生存率為（40±2）%，；CTB006 對 HELF 細胞隨濃度變化細胞生存率維持在（98±5）%，無增殖抑制作用。

2.2 抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 對結(jié)直腸癌細胞抑制增殖的影響

不同濃度 CTB006、5-FU 以及聯(lián)合用藥組對結(jié)直腸癌 4株細胞系存活率的影響見圖1。CTB006 對早期結(jié)直腸癌細胞 SW1116 抑制增殖效果欠佳；對中晚期結(jié)直腸癌細胞 SW480、SW620和 Colo205 有著良好的抑制增殖作用。對單一細胞取藥物濃度為CTB006 0.47 nmol/L 和 5-FU 400 μmol/L 時的細胞存活率，采用完全隨機設(shè)計的方差分析對結(jié)果進行分析，分析其不同作用方式差異。SW1116（F= 12.38，F(xiàn)0.01(2,6)= 10.92，12.38 ＞F0.01(2,6)，P＜0.01）；SW480（F= 7.92，F(xiàn)0.05(2,6)=5.14，7.92 ＞F0.05(2,6)，P＜0.05）；SW620（F= 54.46，F(xiàn)0.01(2,6)= 10.92，54.46 ＞F0.01(2,6)，P＜0.01）；Colo205（F= 57.92，F(xiàn)0.01(2,6)= 10.92，57.92 ＞F0.01(2,6)，P＜0.01）。認為CTB006、5-FU 和聯(lián)合用藥三種不同給藥方式作用后，總體存活率均數(shù)不全相等，存在統(tǒng)計學(xué)差異，即不同給藥方式的抑瘤效果有差別（P＜0.05）。采用隨機區(qū)組設(shè)計分析 CTB006 不同濃度對四株結(jié)直腸細胞存活率差異（F= 20.21，F(xiàn)0.01(3,12)= 5.95，20.21 ＞F0.01(3,12)，P＜0.01），認為相同濃度的 CTB006 對 4 種不同細胞的抑瘤效果有差別（P＜0.01）。當 CTB006 聯(lián)合使用 5-FU后，對中晚期細胞 SW480、SW620 和 Colo205 殺傷效果明顯提升，并呈劑量依賴關(guān)系，CI＜1 表現(xiàn)為協(xié)同作用（表1）。對于早期結(jié)直腸細胞 SW1116，CI ≥ 1，兩藥作用表現(xiàn)為拮抗或相加。

圖1 抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 合用對結(jié)直腸癌細胞系增殖的影響（±s ，n = 3）Figure 1 The inhibitory effect of anti-human DR5 monoclonal antibody CBT006 combined with 5-FU on the proliferation of colorectal cancer cell lines (±s , n = 3)

表1 CTB006 和 5-FU 聯(lián)合作用系數(shù)（CI）（±s ，n = 3）Table 1 Combination index of CBT006 and 5-FU (±s , n = 3)

表1 CTB006 和 5-FU 聯(lián)合作用系數(shù)（CI）（±s ，n = 3）Table 1 Combination index of CBT006 and 5-FU (±s , n = 3)

CI(CTB006 + 5-FU)濃度Drug concentration SW1116 SW480 SW620 Colo205 1.88 nmol/L + 1600 μmol/L 1.52±0.18 0.71±0.22 0.58±0.19 0.90±0.14 0.94 nmol/L + 800 μmol/L 1.23±0.04 0.72±0.08 0.90±0.12 0.94±0.04 0.47 nmol/L + 400 μmol/L 1.06±0.02 0.95±0.28 0.93±0.13 0.87±0.06 0.24 nmol/L + 200 μmol/L 1.07±0.06 0.98±0.26 0.96±0.19 0.98±0.03 0.12 nmol/L + 100 μmol/L 0.99±0.08 0.98±0.26 0.97±0.14 0.93±0.09

圖2 結(jié)直腸癌細胞膜表面 DR5 表達水平Gated%（±s ，n = 3）（空心黑色圖形為陰性對照組 DR5 結(jié)合率，紅色圖形為該細胞表面 DR5 表達情況）Figure 2 The expression of colorectal cancer cell surface DR5 levels (±s , n = 3) (The hollow black graphics for DR5 binding negative control group, the red graphic expression of the cell surface DR5)

2.3 不同結(jié)直腸癌細胞表面 DR5 表達水平差異

不同分期結(jié)直腸癌腫瘤細胞表面 DR5 的表達水平有較大的差異。早期 SW1116 細胞 DR5 的表達水平較低，早中期 SW480 細胞呈中水平表達DR5，中晚期 SW620、Colo205 細胞呈中高水平表達 DR5（圖2）。采用Gated%指標利用區(qū)組方差分析統(tǒng)計，不同結(jié)直腸癌細胞表面的 DR5 表達水平有統(tǒng)計學(xué)差異（F= 5.17，F(xiàn)0.05(3,12)= 3.49，5.17 ＞F0.05(3,12)，P＜0.05）。

3 討論

3.1 抗 DR5 單克隆抗體的藥理作用

腫瘤細胞對化療藥物的耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，且長期使用化療藥物存在大量毒副作用。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）能誘導(dǎo)多種腫瘤細胞和轉(zhuǎn)化細胞發(fā)生凋亡，降低毒副反應(yīng)，而 TRAIL 是通過其受體 DR4 （TRAIL-R1）及 DR5（TRAIL-R2）結(jié)合介導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的[6]。DR4、DR5 屬于 TNFR（TNF receptor）基因超家族，均為I 型跨膜蛋白，兩者有 55%同源。兩者在細胞外區(qū)域都含有兩段富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domains，CRDs），細胞內(nèi)區(qū)域有與TNFR、Fas 等同源的一段 70 個氨基酸的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）。由于都含有 DD，DR4和 DR5 在與 TRAIL 結(jié)合后都可傳導(dǎo)死亡信號而誘導(dǎo)細胞凋亡，所以被稱作死亡受體，它們可在人體多種組織中表達[7]。

但一些研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL 對正常肝細胞有毒性作用，限制了其臨床應(yīng)用[8]。Ichikawa等[9]實驗表明抗 DR4、DR5 單克隆抗體能模擬 TRAIL 誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，且對人正常肝細胞沒有毒副作用。雖然 DR4 和 DR5 在 4℃與 TRAIL 具有相似的結(jié)合力，但在 37℃DR5 與 TRAIL 的親和力最強[10]。LaVallee 等[11]研究表明，TRAIL 與臨床常用化療藥物對腫瘤細胞具有協(xié)同殺傷作用，提示TRAIL 死亡受體（DR4、DR5）的功能性單抗亦可能增強化療藥物殺傷腫瘤細胞作用。上述結(jié)果說明，DR5 在 TRAIL 誘導(dǎo)細胞凋亡方面十分重要。

3.2 抗 DR5 單克隆抗體的臨床應(yīng)用

近年來國內(nèi)外報道文獻多為鼠源性單抗[12–13]，在臨床治療中主要存在的問題是產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)，而且尚未見針對其進行臨床分期系統(tǒng)性研究，亦未見到應(yīng)用人源化抗體協(xié)同 5-FU增效作用的報告。本實驗采用的人源性抗人 DR5特異性單克隆抗體 CTB006，HAMA 反應(yīng)率較鼠源性單抗低，且從美國 ATCC 引進了針對結(jié)直腸癌臨床 Duke’s 分期的細胞系 SW1116（Duke’s A期）、SW480（Duke’s B 期）、SW620（Duke’s C 期）和 Colo205（Duke’s D 期），結(jié)合 5-FU 進行協(xié)同作用研究。

本研究表明：相對于 5-FU，人源 DR5 單抗CTB006 并未見對正常細胞株 HELF 有抑制作用，符合目前低毒、高效的分子靶向藥物治療趨勢。CTB006 對早期 SW1116 抑制增殖效果欠佳，聯(lián)合應(yīng)用 5-FU 主要表現(xiàn)為拮抗作用。我們認為可能是因為早期結(jié)直腸癌組織癌變只侵犯黏膜層，惡變程度低，細胞表面 DR5 表達量亦低，從而導(dǎo)致抗體效應(yīng)較差。這也與目前臨床應(yīng)用指南中對于Duke’s A 期患者不推薦使用輔助性化療不謀而合。CTB006 對中晚期結(jié)直腸癌細胞 SW480、SW620和Colo205 有著良好的增殖抑制作用，抑制率可達到 40%～90%，CTB006 聯(lián)合應(yīng)用 5-FU，存在顯著的協(xié)同增效趨勢，達到相同療效時可以顯著減少兩者的用量，減少毒副作用的同時保證療效。

結(jié)合流式細胞儀檢測細胞 DR5 表達量分析可得出細胞抑制率和細胞膜表面 DR5 表達量呈正相關(guān)。我們認為隨病程進展，結(jié)直腸癌細胞表面 DR5表達逐步升高，引發(fā)該效應(yīng)靶點反應(yīng)增加，從而使藥效增強。雖然國際上普遍認為死亡受體膜表達與細胞殺傷存在聯(lián)系可能性不大，但在目前尚未尋找到更好的高效指示劑的條件下檢測膜表面受體表達量不失為一個彌補辦法[14]。據(jù)報道多種化療藥物可上調(diào) DR5 表達增強治療效果[15]，從另一方面提供了其作為指示劑的佐證。

由于我們選用細胞的局限性，目前我們針對Duke’s 臨床分期結(jié)果觀察到的研究結(jié)果還需擴展細胞系種類來驗證。另外，還有待于進一步從分子機制深化實驗研究，從而為今后動物實驗和臨床工作提供依據(jù)。

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