鞠瑞，武丹威，郭磊，李娟，葉菜英，張德昌

非細(xì)胞毒抗腫瘤藥物羧胺三唑（carboxyamidotriazole，CAI）具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制血管形成等作用[1-3]。而我們?cè)谥暗难芯恐行掳l(fā)現(xiàn) CAI 在一系列急慢性炎癥模型中表現(xiàn)出抗炎作用，能夠顯著抑制炎癥介質(zhì)——腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的釋放[4]。因此在本文中，我們首先提出了 CAI 對(duì)腫瘤環(huán)境中 TNF-α 也有調(diào)控作用的假設(shè)。TNF-α 不僅是炎癥反應(yīng)中十分重要的一種細(xì)胞因子，在腫瘤發(fā)生階段和侵襲轉(zhuǎn)移階段也扮演促進(jìn)腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵角色，是促進(jìn)血管形成的一種重要的細(xì)胞因子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)也依賴于 TNF-α 的調(diào)控[5]。地塞米松（dexamethasone，DEX）是一種皮質(zhì)類固醇藥物，具有很強(qiáng)的抗炎作用，能抑制巨噬細(xì)胞分泌包括TNF-α 在內(nèi)的多種炎性細(xì)胞因子，在腫瘤的治療中也十分常見(jiàn)[6]。在本項(xiàng)研究中，我們研究了 CAI 與小劑量 DEX 聯(lián)合應(yīng)用（combination，COM）是否能增強(qiáng) CAI 對(duì)移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用以及是否能進(jìn)一步降低 TNF-α 在腫瘤環(huán)境中的含量；給予TNF-α 特異性拮抗劑——英夫利昔單抗（TNF-α antibody，TAB）研究 TNF-α 在該模型腫瘤生長(zhǎng)中的作用；并對(duì)腫瘤組織內(nèi)的血管用 CD31 抗體進(jìn)行染色以初步解釋藥物作用。目前的 CAI 單獨(dú)應(yīng)用或與化療藥物合用的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，CAI 治療腫瘤的療效并不理想，合并用藥方案也未能有效地使抗腫瘤作用增強(qiáng)[7-9]。優(yōu)化 CAI 的抗腫瘤作用和發(fā)展新的聯(lián)合用藥方案具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 A549 肺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40 只 6～8 周齡裸小鼠，體重18～20 g，合格證號(hào)：0156072，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物所。在溫度（22±2）℃、濕度 40%～70%、每日12 h 光照環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.3 試劑 CAI 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所提供；聚乙二醇 400（PEG 400）購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司；DEX 購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；胎牛血清購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；CD31 抗體（MEC13.3）購(gòu)自美國(guó) Biolegend 公司；OCT 包埋劑、FITC 標(biāo)記的山羊抗大鼠 IgG 二抗購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó) R&D 公司。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 ThermoForma Series II 水套CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；CM1900 型冰凍切片機(jī)和 DM5000B 型熒光顯微鏡均購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；Synogen 4 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)基因公司。

1.2 方法

1.2.1 體外細(xì)胞培養(yǎng) A549 細(xì)胞用 RPMI1640培養(yǎng)基（加入 10%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、50 mg/ml 青霉素和 100 mg/ml 鏈霉素）在 37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 A549 移植瘤模型 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 A549 細(xì)胞，用 PBS 調(diào)整細(xì)胞密度至 2×107個(gè)/ml，向每只裸小鼠右側(cè)腋窩內(nèi)注射 0.1 ml，即 2×106個(gè)/只。接種后將小鼠隨機(jī)分為5 組：溶劑 PEG 400 組、CAI 組、DEX 組、CAI 與 DEX合用（COM）組和英夫利昔單抗（TAB）組，每組8 只小鼠。接種 A549 細(xì)胞后第2 天給藥：PEG 400 組和 CAI 組小鼠每天灌胃給藥一次，0.1 ml/10 g 體重，CAI 劑量為20 mg/kg；DEX 組每周背部皮下注射給藥兩次，劑量為1 mg/kg；CAI 和DEX 合用組給藥方式和劑量為：CAI 每天灌胃給藥一次，劑量為20 mg/kg，DEX 每周背部皮下注射給藥兩次，劑量為1 mg/kg；英夫利昔單抗每周腹腔注射給藥兩次，劑量為10 mg/kg。給藥 40 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織并稱重。將一部分腫瘤組織浸入 OCT 包埋劑，在液氮液面上方凍成硬塊，保存于 –80℃，以備制成冰凍切片；將一部分腫瘤組織保存于 –80℃，以備勻漿。

1.2.3 腫瘤組織 CD31 血管染色 將 OCT 包埋的腫瘤組織用冰凍切片機(jī)制成 8 μm 冰凍切片，將切片立即置于甲醇中固定 2min 后浸于 pH 7.4 PBS 中清洗，之后滴加 5%牛血清白蛋白（BSA）在 37℃孵育 40min。用 pH 7.4 PBS 清洗后滴加大鼠抗小鼠 CD31 一抗（1∶200 稀釋）孵育，4℃過(guò)夜。第2 天將切片在室溫平衡 1 h 后，用 pH 7.4 PBS 清洗 5min 并重復(fù) 3 次，然后滴加 FITC 標(biāo)記的山羊抗大鼠 IgG 二抗，室溫避光孵育 2 h 后，用 pH 7.4 PBS 清洗，5min×3。封片后用熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.4 腫瘤組織內(nèi) TNF-α 含量檢測(cè) 每組取4 個(gè)腫瘤組織，在液氮冷凍條件下用研缽將腫瘤組織研磨成粉末，然后收集于試管中稱重，按 500 μl/g組織的比例向粉末中加入放射免疫沉淀裂解液（radio immuno precipitation assay，RIPA），其中含苯甲基磺酰氟（PMSF）1mmol/L、二硫蘇糖醇（DTT）1mmol/L、亮抑酶肽（leupeptin）5 μg/ml、抑蛋白酶肽（aproptinin）5 μg/ml，置冰上使用組織勻漿器勻漿 30 s，將組織懸液在 4℃以 15 000×g超速離心 30min。取離心上清，用 Bradford 方法對(duì)總蛋白進(jìn)行定量。用 ELISA 試劑盒檢測(cè)腫瘤組織蛋白勻漿中 TNF-α 的濃度，用 TNF-α 濃度/總蛋白濃度表示 TNF-α 在腫瘤組織蛋白勻漿中的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)照組與給藥組檢測(cè)結(jié)果的比較采用 Student’st檢驗(yàn)，以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2 結(jié)果

2.1 CAI 和（或）DEX 對(duì) A549 移植瘤生長(zhǎng)的抑制作用

A549 移植瘤模型建立 40 d 后，處死小鼠并剝離瘤組織，發(fā)現(xiàn)藥物合用組的腫瘤組織體積明顯小于溶劑對(duì)照 PEG 組（圖1）。各組瘤重分別為：PEG 組（0.23±0.04）g；CAI 組（0.21±0.02）g；DEX 組（0.17±0.04）g；COM 組（0.12±0.03）g；TAB 組（0.17±0.04）g（圖2）。CAI 與 DEX 合用使瘤重降低了 49.1%。

圖1 A549 移植瘤模型建立 40 d 后剝離的 PEG 組和COM 組的腫瘤組織，分別取 PEG 組和 COM 組 4 個(gè)腫瘤組織進(jìn)行照相Figure 1 Tumor tissues isolated after 40 days of treatment in the A549 xenograft tumor model, 4 tumor tissues in PEG or COM group were taken for photos

圖2 A549 移植瘤模型建立 40 d 后各組瘤重，給藥 40 d后處死小鼠，剝離腫瘤組織并稱重（n = 8）。*，與 PEG 組相比P＜0.01Figure 2 Tumor weights after 40 days of treatment in the A549 xenograft tumor model.The tumors were isolated and weighed after 40 days of treatment (n = 8).*,P＜0.01,compared with PEG group.

2.2 CAI 和（或）DEX 對(duì) A549 移植瘤組織內(nèi)血管生成的抑制作用

我們對(duì)各組腫瘤組織冰凍切片進(jìn)行 CD31 熒光染色觀察血管數(shù)目的變化，發(fā)現(xiàn) CAI 和 DEX均能減少血管生成，而藥物合用組中的血管數(shù)目被降至更低水平（圖3）。

圖3 各組腫瘤組織內(nèi)血管染色，將腫瘤組織 8 μm 冰凍切片用大鼠抗小鼠 CD31 一抗和 FITC 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG 二抗依次孵育，封片后用熒光顯微鏡觀察照相（10×）（A：PEG；B：CAI；C：DEX；D：COM）Figure 3 Immuno-fluorescent staining for CD31 in tumor tissues.The frozen sections (8 μm) were incubated with anti-mouse CD31 primary antibody and followed by FITC-conjugated second antibody.The photos were captured by a fluorescent microscope (10×) (A: PEG; B: CAI; C: DEX;D: COM)

2.3 CAI 和（或）DEX 降低 A549 移植瘤組織TNF-α的含量

我們對(duì)各組腫瘤組織勻漿中 TNF-α 的含量進(jìn)行了測(cè)定。PEG、CAI、DEX、COM 和 TAB 組腫瘤組織勻漿中 TNF-α 的含量分別為（933.9±286.8）、（636.1±157.4）、（684.9±170.1）、（364.7±0.1）和（606.8±190.3）pg/mg 蛋白（圖4）。結(jié)果顯示，CAI 和 DEX 單用均可下調(diào) TNF-α 的含量，兩藥合用使 TNF-α 含量降至更低的水平。

圖4 各組腫瘤組織內(nèi) TNF-α 的含量。*，與 PEG 組相比P＜0.01Figure 4 TNF-α concentration in tumor tissues.*,P＜0.01,compared with PEG group.

3 討論

本項(xiàng)研究表明，羧胺三唑（CAI）不僅能夠直接影響腫瘤細(xì)胞[抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的生成等]，還能通過(guò)調(diào)控腫瘤環(huán)境中 TNF-α 控制腫瘤的發(fā)展。DEX 具有抗炎作用，對(duì) TNF-α 的合成有較強(qiáng)的抑制作用，與 CAI 合用后使其抗腫瘤作用增強(qiáng)。

CAI 和 DEX 均能在一定程度上抑制 A549移植瘤的生長(zhǎng)，合用之后的抗腫瘤作用被顯著增強(qiáng)。我們?cè)谠撘浦擦錾L(zhǎng)過(guò)程中給予 TNF-α 抗體藥物英夫利昔單抗，發(fā)現(xiàn)拮抗 TNF-α 能夠使腫瘤生長(zhǎng)減緩。一些臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)確實(shí)表明，英夫利昔單抗能夠穩(wěn)定晚期癌癥患者的病情，其單獨(dú)應(yīng)用和與化療藥物合用均取得了良好的療效[10-12]。針對(duì)促腫瘤發(fā)展細(xì)胞因子 TNF-α 進(jìn)行抗腫瘤治療被廣泛認(rèn)可[13]。

TNF-α 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用較廣，目前研究較多的是其促血管生成作用。在腫瘤微環(huán)境中，TNF-α 可能能夠使骨髓系祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化[14]，VEGF 的變化也依賴于 TNF-α 的調(diào)控[5]。我們對(duì) A549 移植瘤組織的冰凍切片進(jìn)行血管染色后發(fā)現(xiàn)，CAI 能抑制血管的生成，這與目前文獻(xiàn)[15]報(bào)道的 CAI 的血管抑制作用一致。由于在之前的研究中發(fā)現(xiàn) CAI 在急慢性炎癥中均表現(xiàn)出對(duì)TNF-α 釋放的抑制作用，我們提出了 CAI 也能夠調(diào)控腫瘤環(huán)境中 TNF-α 含量的假設(shè)。對(duì)腫瘤組織中 CD31 分子染色，觀察各組血管數(shù)目的差異，結(jié)果顯示 CAI 和 DEX 單用均能減少血管的數(shù)目，這與目前對(duì)兩種藥物的認(rèn)識(shí)一致：CAI 能夠抑制腫瘤細(xì)胞 VEGF 的釋放，而 DEX 也在多種模型上被發(fā)現(xiàn)具有抗血管生成作用，如能夠通過(guò)抑制 H22肝癌細(xì)胞中 VEGF 的表達(dá)抑制 H22 移植瘤的生長(zhǎng)[16]。我們?cè)诒緦?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)兩者合用組的血管數(shù)目降至極低的水平。由于兩種藥物均具有抗炎作用，且 VEGF 的表達(dá)受到 TNF-α 的調(diào)控，我們對(duì)各組腫瘤組織內(nèi) TNF-α 的含量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，CAI 和 DEX 確實(shí)都對(duì)腫瘤組織內(nèi)的 TNF-α 有下調(diào)作用，而兩者合用對(duì)其抑制作用最為明顯，其含量水平甚至低于英夫利昔單抗給藥組。各組TNF-α 含量的差異與各組瘤重的差異吻合。

總之，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了小分子藥物 CAI 與小劑量DEX 合用之后對(duì)腫瘤環(huán)境中 TNF-α生成和 A549移植瘤生長(zhǎng)的強(qiáng)抑制作用，其作用可與 TNF-α 特異性拮抗劑英夫利昔單抗相比，甚至優(yōu)于后者。在給藥過(guò)程中，始終沒(méi)有發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素相關(guān)的不良反應(yīng)，此合用方案有著良好的耐受性。本項(xiàng)研究對(duì)于優(yōu)化 CAI 的抗腫瘤作用有著重要的意義，并為肺癌治療提供了一種可能的聯(lián)合用藥方案。

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