高旭，周正，沈恩允，景曉娟，郭雷鳴，王仙斌，孫勁文，杜云峰

·論著·

抗DR5單抗CTB006聯(lián)合5-FU對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系作用研究

高旭，周正，沈恩允，景曉娟，郭雷鳴，王仙斌，孫勁文，杜云峰

目的探討腫瘤壞死因子相關(guān)誘導(dǎo)配體受體（DR5）激動(dòng)型單抗 CTB006 對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞系 SW1116、SW480、SW620、Colo205 的影響。

結(jié)直腸腫瘤； 受體，TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體； 藥物協(xié)同作用； 氟尿嘧啶

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)，2011，6(2):106-110

結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率在國(guó)內(nèi)外有逐年上升的趨勢(shì)，其中我國(guó)死亡率達(dá)到 7.42/10萬[1]。盡管外科技術(shù)不斷提高，但根治術(shù)后 5 年生存率仍徘徊在 50％ 左右，故多數(shù)學(xué)者主張綜合治療[2]。在生物治療領(lǐng)域，腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體 TRAIL-R1（death receptor4，DR4）及TRAIL-R2（death receptor5，DR5）具有介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的特性，TRAIL受體激動(dòng)劑（包括 TRAIL 和激動(dòng)型抗體）成為國(guó)際上研究新方向。本實(shí)驗(yàn)室利用人源化抗人 DR5 激動(dòng)型單克隆抗體 CTB006，結(jié)合臨床結(jié)直腸癌 Duke’s 臨床分期，分別選用SW1116（Duke’s A 期）、SW480（Duke’s B 期）、SW620（Duke’s C 期）和 Colo205（Duke’s D 期）結(jié)直腸癌細(xì)胞，研究 CTB006 對(duì)之誘導(dǎo)凋亡作用，同時(shí)觀察治療效果和受體表達(dá)有無相關(guān)性，并與化療藥物 5-氟尿嘧啶（5-FU）聯(lián)用，觀察有無協(xié)同殺傷作用，為 CTB006 的臨床腫瘤治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗人 DR5 單克隆抗體 CTB006 由北京同為時(shí)代生物技術(shù)有限公司提供；不同分期結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW1116、SW480、SW620、Colo205 和人胚肺成纖維細(xì)胞（HELF）購(gòu)自美國(guó)模式菌種收藏中心（ATCC）；細(xì)胞培養(yǎng)材料、胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó) GIBCO 公司；ATPlite 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)PerkinElmer 公司（批號(hào)：0RD00694）；羊抗人IgG-RPE（批號(hào)：1031-09）、羊抗人 RPE（批號(hào)：A0808-PB59）為美國(guó) Southern Biotech 公司產(chǎn)品；5-FU 為上海旭東海普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：090807）。BHP9504-2 型微孔板發(fā)光分析儀為北京濱松光子技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Cytomics? FC500 型流式細(xì)胞儀為美國(guó) Beckman Coulter 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將 SW1116、SW480、SW620 和HELF 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10％ FBS、0.1％ 青霉素 + 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)液；Colo205 細(xì)胞培養(yǎng)于含 10 mmol/L HEPES緩沖液、1 mmol/L 丙酮酸鈉、10％ FBS、0.1％ 青霉素 + 鏈霉素的 RPMI 1640 培養(yǎng)液。在 37 ℃，含 5％ CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 ～ 5 d，用 0.25％ 胰酶消化，以 1∶1 ～ 1∶3傳代，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2ATPlite 法檢測(cè)抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 合用對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖的影響

1.2.2.1實(shí)驗(yàn)分組及劑量 把 SW1116、SW480、SW620、Colo205 分別設(shè) CTB006 組、CTB006 + 5-FU 合用組和 5-FU 組。CTB006 組給予劑量分別為 1.88、0.94、0.47、0.24、0.12 nmol/L，1 h 后 CTB006 組和聯(lián)合用藥組加羊抗人 RPE 二抗；5-FU 組劑量分別為 1600、800、400、200、100 μmol/L；CTB006 + 5-FU 合用組依照上述兩藥濃度梯度共同給藥。另設(shè) CTB006 和 5-FU 單用組用于評(píng)價(jià)CTB006對(duì) HELF 細(xì)胞的靶向治療作用。各組均設(shè)陰性對(duì)照[3]。

1.2.2.2ATPlite 法檢測(cè)細(xì)胞存活率[4]用 0.25％胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含相應(yīng) DMEM 或 RPMI1640培養(yǎng)液配成 6 × 104個(gè)/L 單個(gè)細(xì)胞懸液，按每孔50 μl 接種于 96 孔板，CO2孵箱（37 ℃，5％ CO2）內(nèi)培養(yǎng) 24 h 后加上述各組藥物，每組 3 個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為 100 μl。48 h 后依照 ATPlite 試劑盒說明每孔加入 50 μl 細(xì)胞裂解液，震蕩 3 min。吸取裂解上清 50 μl 于酶標(biāo)板中，再加入 25 μl 發(fā)光液，震蕩 10 s 后，避光靜置 3 min。將孵育好的酶標(biāo)板放入發(fā)光儀，讀取發(fā)光值。使用 BHP9504微孔板發(fā)光分析儀 4.3.32 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。細(xì)胞存活率（survival rate）=（樣品發(fā)光值平均值/對(duì)照組發(fā)光值平均值）× 100％。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值。

評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制是否有協(xié)同作用，采用兩種藥物聯(lián)合作用系數(shù)（combination index，CI），CI = AB/(A × B)，根據(jù)活細(xì)胞數(shù)（發(fā)光度值）進(jìn)行計(jì)算。AB 是兩藥聯(lián)合組與對(duì)照組的比值；A 和 B 是各藥單獨(dú)使用組與對(duì)照組的比值。如 CI ＜ 1，證明兩藥作用性質(zhì)為協(xié)同；如 CI = 1，則兩藥無相互作用；如 CI ＞ 1，則兩藥作用性質(zhì)為拮抗[5]。

1.2.3流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系表面DR5 表達(dá) 將消化好的結(jié)直腸癌細(xì)胞，用含 2％ FBS 的 PBS 洗液 524 ×g離心 4 min。細(xì)胞盡量要求為單個(gè)。計(jì)數(shù)后將細(xì)胞稀釋為 2 × 106個(gè)/ml，加入 96 孔圓底板中，每孔 50 μl。將 CTB006 稀釋為 15 nmol/L，取 50 μl 與細(xì)胞混合，使終濃度為 7.5 nmol/L。冰上孵育 1 h。洗液洗 2 次，524 ×g離心，每次 4 min。羊抗人 IgG-RPE 1∶250 稀釋，取 20 μl 加入各孔中，混勻細(xì)胞。同時(shí)設(shè)只加二抗的陰性對(duì)照。冰上孵育 15 min。洗液 524 ×g洗 2 次，每次 4 min。每管加入 300 μl 洗液，4 ℃ 下放置，30 min 內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。用 WinMID 2.9 軟件分析結(jié)果，求出各株細(xì)胞表面DR5與抗體結(jié)合率Gated％。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抗人 DR5 單抗 CTB006 的靶向治療作用

四株結(jié)直腸癌細(xì)胞及 HELF 均生長(zhǎng)狀態(tài)良好。SW1116、SW480、SW620 為貼壁生長(zhǎng)，Colo205為半懸浮生長(zhǎng)。5-FU 對(duì) HELF 細(xì)胞增殖抑制明顯，且呈劑量依賴，濃度為 100 μmol/L 時(shí)細(xì)胞生存率為（89 ± 1）％，400 μmol/L 時(shí)細(xì)胞生存率為（60 ± 1.3）％，1600 μmol/L 時(shí)細(xì)胞生存率為（40 ± 2）％，；CTB006 對(duì) HELF 細(xì)胞隨濃度變化細(xì)胞生存率維持在（98 ± 5）％，無增殖抑制作用。

2.2 抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞抑制增殖的影響

不同濃度 CTB006、5-FU 以及聯(lián)合用藥組對(duì)結(jié)直腸癌 4 株細(xì)胞系存活率的影響見圖 1。CTB006 對(duì)早期結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW1116 抑制增殖效果欠佳；對(duì)中晚期結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW480、SW620 和 Colo205 有著良好的抑制增殖作用。對(duì)單一細(xì)胞取藥物濃度為 CTB006 0.47 nmol/L 和 5-FU 400 μmol/L 時(shí)的細(xì)胞存活率，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，分析其不同作用方式差異。SW1116（F= 12.38，F(xiàn)0.01(2，6)= 10.92，12.38 ＞F0.01(2，6)，P＜ 0.01）；SW480（F= 7.92，F(xiàn)0.05(2，6)= 5.14，7.92 ＞F0.05(2，6)，P＜ 0.05）；SW620（F= 54.46，F(xiàn)0.01(2，6)= 10.92，54.46 ＞F0.01(2，6)，P＜ 0.01）；Colo205 （F= 57.92，F(xiàn)0.01(2，6)= 10.92，57.92 ＞F0.01(2，6)，P＜0.01）。認(rèn)為 CTB006、5-FU 和聯(lián)合用藥三種不同給藥方式作用后，總體存活率均數(shù)不全相等，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，即不同給藥方式的抑瘤效果有差別（P＜ 0.05）。采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分析 CTB006 不同濃度對(duì)四株結(jié)直腸細(xì)胞存活率差異（F= 20.21，F(xiàn)0.01(3，12)= 5.95，20.21 ＞F0.01(3，12)，P＜ 0.01），認(rèn)為相同濃度的 CTB006 對(duì) 4 種不同細(xì)胞的抑瘤效果有差別（P＜ 0.01）。當(dāng) CTB006 聯(lián)合使用 5-FU后，對(duì)中晚期細(xì)胞 SW480、SW620 和 Colo205 殺傷效果明顯提升，并呈劑量依賴關(guān)系，CI ＜ 1 表現(xiàn)為協(xié)同作用（表 1）。對(duì)于早期結(jié)直腸細(xì)胞 SW1116，CI ≥ 1，兩藥作用表現(xiàn)為拮抗或相加。

圖1 抗人 DR5 單抗 CTB006 與 5-FU 合用對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞系增殖的影響（±s，n = 3）Figure 1 The inhibitory effect of anti-human DR5 monoclonal antibody CBT006 combined with 5-FU on the proliferation of colorectal cancer cell lines (±s，n = 3)

表1 CTB006 和 5-FU 聯(lián)合作用系數(shù)（CI）（±s，n = 3）Table 1 Combination index of CBT006 and 5-FU (±s ，n = 3)

表1 CTB006 和 5-FU 聯(lián)合作用系數(shù)（CI）（±s，n = 3）Table 1 Combination index of CBT006 and 5-FU (±s ，n = 3)

?

圖2 結(jié)直腸癌細(xì)胞膜表面 DR5 表達(dá)水平Gated％（±s，n = 3）（空心黑色圖形為陰性對(duì)照組 DR5 結(jié)合率，紅色圖形為該細(xì)胞表面 DR5 表達(dá)情況）Figure 2 The expression of colorectal cancer cell surface DR5 levels (±s，n = 3) (The hollow black graphics for DR5 binding negative control group，the red graphic expression of the cell surface DR5)

2.3 不同結(jié)直腸癌細(xì)胞表面 DR5 表達(dá)水平差異

不同分期結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞表面 DR5 的表達(dá)水平有較大的差異。早期 SW1116 細(xì)胞 DR5 的表達(dá)水平較低，早中期 SW480 細(xì)胞呈中水平表達(dá)DR5，中晚期 SW620、Colo205 細(xì)胞呈中高水平表達(dá) DR5（圖 2）。采用 Gated％ 指標(biāo)利用區(qū)組方差分析統(tǒng)計(jì)，不同結(jié)直腸癌細(xì)胞表面的 DR5 表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F = 5.17，F(xiàn)0.05(3，12)= 3.49，5.17 ＞ F0.05(3，12)，P ＜ 0.05）。

3 討論

3.1 抗 DR5 單克隆抗體的藥理作用

腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥是導(dǎo)致治療失敗的主要原因，且長(zhǎng)期使用化療藥物存在大量毒副作用。腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞發(fā)生凋亡，降低毒副反應(yīng)，而 TRAIL 是通過其受體 DR4 （TRAIL-R1）及 DR5（TRAIL-R2）結(jié)合介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的[6]。DR4、DR5 屬于 TNFR（TNF receptor）基因超家族，均為 I 型跨膜蛋白，兩者有 55％ 同源。兩者在細(xì)胞外區(qū)域都含有兩段富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（cysteine-rich domains，CRDs），細(xì)胞內(nèi)區(qū)域有與TNFR、Fas 等同源的一段 70 個(gè)氨基酸的死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）。由于都含有 DD，DR4 和 DR5 在與 TRAIL 結(jié)合后都可傳導(dǎo)死亡信號(hào)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，所以被稱作死亡受體，它們可在人體多種組織中表達(dá)[7]。

但一些研究發(fā)現(xiàn)，TRAIL 對(duì)正常肝細(xì)胞有毒性作用，限制了其臨床應(yīng)用[8]。Ichikawa等[9]實(shí)驗(yàn)表明抗 DR4、DR5 單克隆抗體能模擬 TRAIL 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且對(duì)人正常肝細(xì)胞沒有毒副作用。雖然 DR4 和 DR5 在 4 ℃ 與 TRAIL 具有相似的結(jié)合力，但在 37 ℃ DR5 與 TRAIL 的親和力最強(qiáng)[10]。LaVallee 等[11]研究表明，TRAIL 與臨床常用化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有協(xié)同殺傷作用，提示TRAIL 死亡受體（DR4、DR5）的功能性單抗亦可能增強(qiáng)化療藥物殺傷腫瘤細(xì)胞作用。上述結(jié)果說明，DR5 在 TRAIL 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面十分重要。

3.2 抗 DR5 單克隆抗體的臨床應(yīng)用

近年來國(guó)內(nèi)外報(bào)道文獻(xiàn)多為鼠源性單抗[12–13]，在臨床治療中主要存在的問題是產(chǎn)生人抗鼠抗體（HAMA）反應(yīng)，而且尚未見針對(duì)其進(jìn)行臨床分期系統(tǒng)性研究，亦未見到應(yīng)用人源化抗體協(xié)同 5-FU增效作用的報(bào)告。本實(shí)驗(yàn)采用的人源性抗人 DR5特異性單克隆抗體 CTB006，HAMA 反應(yīng)率較鼠源性單抗低，且從美國(guó) ATCC 引進(jìn)了針對(duì)結(jié)直腸癌臨床 Duke’s 分期的細(xì)胞系 SW1116（Duke’s A期）、SW480（Duke’s B 期）、SW620（Duke’s C 期）和Colo205（Duke’s D 期），結(jié)合 5-FU 進(jìn)行協(xié)同作用研究。

本研究表明：相對(duì)于 5-FU，人源 DR5 單抗CTB006 并未見對(duì)正常細(xì)胞株 HELF 有抑制作用，符合目前低毒、高效的分子靶向藥物治療趨勢(shì)。CTB006 對(duì)早期 SW1116 抑制增殖效果欠佳，聯(lián)合應(yīng)用 5-FU 主要表現(xiàn)為拮抗作用。我們認(rèn)為可能是因?yàn)樵缙诮Y(jié)直腸癌組織癌變只侵犯黏膜層，惡變程度低，細(xì)胞表面 DR5 表達(dá)量亦低，從而導(dǎo)致抗體效應(yīng)較差。這也與目前臨床應(yīng)用指南中對(duì)于Duke’s A 期患者不推薦使用輔助性化療不謀而合。CTB006 對(duì)中晚期結(jié)直腸癌細(xì)胞 SW480、SW620 和Colo205 有著良好的增殖抑制作用，抑制率可達(dá)到 40％ ～ 90％，CTB006 聯(lián)合應(yīng)用 5-FU，存在顯著的協(xié)同增效趨勢(shì)，達(dá)到相同療效時(shí)可以顯著減少兩者的用量，減少毒副作用的同時(shí)保證療效。

結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞 DR5 表達(dá)量分析可得出細(xì)胞抑制率和細(xì)胞膜表面 DR5 表達(dá)量呈正相關(guān)。我們認(rèn)為隨病程進(jìn)展，結(jié)直腸癌細(xì)胞表面 DR5表達(dá)逐步升高，引發(fā)該效應(yīng)靶點(diǎn)反應(yīng)增加，從而使藥效增強(qiáng)。雖然國(guó)際上普遍認(rèn)為死亡受體膜表達(dá)與細(xì)胞殺傷存在聯(lián)系可能性不大，但在目前尚未尋找到更好的高效指示劑的條件下檢測(cè)膜表面受體表達(dá)量不失為一個(gè)彌補(bǔ)辦法[14]。據(jù)報(bào)道多種化療藥物可上調(diào) DR5 表達(dá)增強(qiáng)治療效果[15]，從另一方面提供了其作為指示劑的佐證。

由于我們選用細(xì)胞的局限性，目前我們針對(duì)Duke’s 臨床分期結(jié)果觀察到的研究結(jié)果還需擴(kuò)展細(xì)胞系種類來驗(yàn)證。另外，還有待于進(jìn)一步從分子機(jī)制深化實(shí)驗(yàn)研究，從而為今后動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床工作提供依據(jù)。

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Effects of the combination of anti-human DR5 monoclonal antibody and 5-Fluorouracil on the proliferation of colorectal cancer cells in vitro

GAO Xu，ZHOU Zheng，SHEN En-yun，JING Xiao-juan，GUO Lei-ming，WANG Xian-bin，SUN Jin-wen，DU Yun-feng

ObjectiveTo approach the effects of the combination of tumor necrosis factor-related inducing ligand receptor (DR5) monoclonal antibody CBT006 and 5-Fluorouracil (5-FU) on the proliferation of human colorectal cancer cells.MethodsATPlite assay was used to detect the influences of CBT006 and 5-FU alone or in combination on the proliferation of human colorectal cancer cells including SW1116，SW480，SW620 and Colo205 in different pathological stages. The expression of cell surface DR5 levels were examined by using flow cytometry. In the end，we investigated the relationship between the influences and the expression level of DR5.ResultsCTB006 and 5-FU decreased the survival of the colorectal cancer SW1116，SW480，SW620 and Colo205 cells. There exited bad effect on the proliferation of SW1116 at an early pathological stage by CTB006，but it showed a good inhibitory effect of the growth of advanced colorectal cancer SW480，SW620 and Colo205 cells. There was a synergistic effect of the combination of CBT006 and 5-FU on the survial of advanced colorectal cancer cells. By flow cytometry，DR5 expression levels were (47.01 ± 30.4)％，(76.11 ± 15.1)％，(86.77 ± 9.3)％，(93.55 ± 7.9)％ in SW1116 cells，SW480 cells，SW620 cells and Colo205，respectively.ConclusionsCBT006 showed strong inhibitory effect on the proliferation of advanced colorectal caner cells and exerted synergistic effects on these cancer cells when combined with 5-FU.

Colorectal neoplasms; Receptor，TNF-related apoptosis-inducing ligand; Drug synergism; Fluorouracil

s:ZHOU Zheng，Email: zhzh0386_cn@sina.com; SHEN En-yun，Email: eyshen@cotimesbiotech.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.005

063000 唐山，華北煤炭醫(yī)學(xué)院研究生部（高旭、王仙斌）；100028 北京，煤炭總醫(yī)院普外腫瘤科（周正、孫勁文、杜云峰）；100176北京同為時(shí)代生物技術(shù)有限公司（沈恩允、郭雷鳴）；100091 北京，中國(guó)人民解放軍總參謀部總醫(yī)院內(nèi)分泌科（景曉娟）

周正，Email：zhzh0386_cn@sina.com；沈恩允，Email：eyshen@cotimesbiotech.com

2010-12-09

方法采用 ATPlite 法檢測(cè) CTB006 組、5-FU 組及兩藥物合用組作用后的細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞系表面 DR5 的表達(dá)水平，研究?jī)烧咧g的關(guān)系。

結(jié)果CTB006 和 5-FU 對(duì)四種結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖均表現(xiàn)出抑制作用。CTB006 對(duì)早期細(xì)胞 SW1116 增殖抑制效果欠佳，對(duì)中晚期細(xì)胞 SW480、SW620、Colo205 有著良好的增殖抑制作用（P ＜ 0.05）。當(dāng)聯(lián)合使用 5-FU 后，對(duì)后三者有明顯的協(xié)同作用。流式細(xì)胞儀檢測(cè) DR5 表達(dá)水平，SW1116 細(xì)胞表達(dá)（47.01 ± 30.4）％，SW480 細(xì)胞表達(dá)（76.11 ± 15.1）％，SW620 細(xì)胞表達(dá)（86.77 ± 9.3）％，Colo205 細(xì)胞表達(dá)（93.55 ± 7.9）％。

結(jié)論 CTB006 對(duì)中晚期結(jié)直腸癌殺傷作用較強(qiáng)，聯(lián)用5-FU 具有顯著的協(xié)同作用。

Author Affiliations:Graduate Department of North China Coal Medical University，Tangshan 063000，China (GAO Xu，WANG Xian-bin); Oncology and General Surgery Department，Coal General Hospital，Beijing 100028，China (ZHOU Zheng，SUN Jin-wen，DU Yun-feng); Beijing Cotimes Biotechnology Co.，Ltd，Beijing 100176，China (SHEN En-yun，GUO Lei-ming); Endocrinology Department of General Hospital of PLA General Staff Headquarters，Beijing 100091，China (JING Xiao-juan)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol，2011，6(2):106-110