李晶,滿(mǎn)來(lái)

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453007；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物研究所,北京100730）

禽流感是由禽甲型流感病毒（AIV）引起的一種禽類(lèi)烈性傳染病.近年禽流感大流行導(dǎo)致數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的家禽死亡,已有100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)發(fā)生了高致病性H5N1型禽流感（人禽流感）病毒對(duì)人類(lèi)的感染,其病例達(dá)400余例,死亡262人.禽流感病毒的傳播已突破物種間屏障,獲得了直接感染人的能力,給人類(lèi)健康帶來(lái)巨大威脅[1].

H5N1病毒借助其包膜表面的血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合,以進(jìn)入宿主細(xì)胞.HA是流感病毒的主要表面糖蛋白,是誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原,具有亞型特異性,同時(shí)可以誘導(dǎo)特異性抗體的產(chǎn)生.一個(gè)HA單體約由562～566個(gè)氨基酸（AA）組成,主要由疏水AA殘基組成；因而可以和病毒囊膜的脂質(zhì)雙層親密相連,其末端的10個(gè)AA殘基多數(shù)是親水的,因而可以透過(guò)脂質(zhì)雙層進(jìn)入病毒粒子內(nèi),HA與病毒粒子的聯(lián)系是很緊密的.在HA1個(gè)HA2之間有1個(gè)或多個(gè)AA組成的短鏈肽相連,它的數(shù)量和排列順序?qū)Σ《镜闹虏⌒杂兄匾饬x[2].

流感病毒表面的HA是宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合蛋白,也是變異最大、流感疫苗研制重要的靶標(biāo)蛋白,獲得具有生物學(xué)功能的HA是對(duì)其進(jìn)行研究的前提.近年來(lái),關(guān)于HA表達(dá)、純化以及蛋白晶體解析的研究都是利用昆蟲(chóng)蛋白表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)成本高,周期長(zhǎng),不適合在一些基礎(chǔ)設(shè)備較弱的地區(qū)使用.本研究利用成本最低、應(yīng)用最廣的原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出具有生物學(xué)功能的HA,將為HA研究提供一種更普遍的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 Escherichia coli BL21（DE3）plysS.購(gòu)于中科院微生物研究所菌株保藏中心.

1.1.2 主要試劑 HA多克隆抗體（北京義翹神州生物技術(shù)有限公司）；蛋白酶抑制劑（Protein Inhibitor Cocktail）、BSA Taq plusDNA聚合酶及緩沖液（Takara公司）；X-gal、IPTG（Promega公司）；低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)（華美公司）；ELISA HRP反應(yīng)底物（萬(wàn)泰生物藥業(yè)有限公司）；Ni柱（GE公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Pierce公司）.

1.1.3 質(zhì)粒 pGEM-TEasy,pET42a（+）用于原核蛋白表達(dá).

1.1.4 H5N1血凝素蛋白來(lái)源 試驗(yàn)用H5N1血凝素蛋白來(lái)源的病毒株見(jiàn)表1.

表1 H5N1病毒株及其來(lái)源

1.2 軟件預(yù)測(cè)HA蛋白胞外段

使用SignalP4.0 Server和TMHMM軟件并參考文獻(xiàn)報(bào)道[4],確定HA蛋白的信號(hào)肽和跨膜區(qū).以XJ為例,HA蛋白胞外段（從17至532位氨基酸）是本研究的目的蛋白序列.

1.3 引物合成

由擎科生物技術(shù)公司合成,序列如下：

HA-pET42a上游 NdEI：GGAATTCCATATGGAAGAAAAAAGAGAGGA

HA-pET42a 下游 BamHI：CGGGATCCCTAGTGATGATGATGATGATGTATTTGGTAAGTTCCTATTGA TTCC

HA1-pET42a 上游 NdEI：GGAATTCCATATGGAAGAAAAAAGAGAGGA

HA1-pET42a下游 BamHI：CGGGATCCCTAGTGATGATGATGATGATGTCCTCTCTTTTTTCTTC

引物序列由北京擎科生物技術(shù)公司合成（該擴(kuò)增在HA的氨基酸殘基范圍17-532AA長(zhǎng)度）.

1.4 PCR擴(kuò)增HA基因片段

分離培養(yǎng)高致病性禽流感H5N1病毒,提取病毒總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈,HA片段PCR,回收,連接入 pCR-BluntⅡ-Topo載體,作為模板.進(jìn)行轉(zhuǎn)化,鑒定,測(cè)序.

1.5 HA蛋白的原核細(xì)胞表達(dá)

挑取單個(gè)經(jīng)過(guò)鑒定確定的pET42-HA和HA1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌落,接種于5 mLLB培養(yǎng)基中,37℃劇烈振蕩培養(yǎng)過(guò)夜.然后將上述菌液按1∶100的比例接種到一個(gè)含有400 mLLB（Kana+）的錐形瓶中,37℃劇烈振蕩培養(yǎng)2 h,并加入終濃度為1 mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)3～4 h.收集培養(yǎng)液,5 000 r/min離心10 min,棄上清.PBS洗菌體,離心,取沉淀.用PBS按照5 mL/g重懸,冰浴下以工作10 sec/400 W/30次,每次間隔30 s的參數(shù),超聲破碎細(xì)胞.12 000 r/min離心20 min,棄上清.沉淀用PBS洗2次后,用8 mol/L尿素溶解沉淀,4℃過(guò)夜.

1.6 重組HA的表達(dá)純化

將溶于8 mol/L尿素中的含有6個(gè)組氨酸標(biāo)記的融合蛋白His-HA以0.45 μm濾膜過(guò)濾,準(zhǔn)備過(guò)柱.將HisTrap kit親和柱用含8 mol/L尿素的10 mL Binding Buffer平衡后,加入已經(jīng)準(zhǔn)備好的待純化樣品His-HA.調(diào)節(jié)流速約為10滴/min.并用10 mL含8 mol/L尿素的BindingBuffer洗柱,使用6 mL含8 mol/L尿素的Elution Buffer洗脫柱子,分管收集洗脫液,取少量進(jìn)行SDS-PAGE鑒定.收集含有目的蛋白的各管,-70℃保存.BCA法測(cè)定純化后的重組HA蛋白濃度.

1.7 重組HA蛋白的鑒定

1.7.1 SDS-PAGE和Western-blotting鑒定 將蛋白樣品和分子量標(biāo)準(zhǔn)與2×上樣緩沖液等體積混合,沸水煮6 min,上樣.Western-blotting使用的一抗是HA小鼠多克隆血清,使用濃度為2 μg/mL.二抗是過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG,抗體1∶5 000稀釋,DAB顯影.

1.7.2 血凝試驗(yàn)鑒定 在“V”型96孔反應(yīng)板上,每孔加入50 μL生理鹽水,于每列第1孔中加入50 μL待測(cè)重組蛋白液,或感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞,或重組桿狀病毒上清混勻后,取出50 μL加到第2孔中混勻后,再取出50 μL加到第3孔中,依此類(lèi)推,直到第11孔混勻后棄去50 μL,此時(shí)病毒液的稀釋度依次為1∶2～1∶2 048,第12孔加50 μL生理鹽水作為紅細(xì)胞懸液對(duì)照.然后,每孔均加入50 μL0.5%雞紅細(xì)胞、小鼠紅細(xì)胞及人紅細(xì)胞懸液,振蕩15 s混勻后,置37℃0.5 h后觀察結(jié)果.在紅細(xì)胞懸液對(duì)照不發(fā)生凝集的條件下,即可進(jìn)行試驗(yàn)組的結(jié)果判讀.判讀標(biāo)準(zhǔn)如下：

血凝試驗(yàn)（Ag+雞血）

++++：定義為凝集的紅細(xì)胞呈薄膜狀均勻覆蓋孔底,強(qiáng)烈凝集時(shí)則皺縮成團(tuán)；

+++：定義為凝集的紅細(xì)胞比較均勻覆蓋孔底,有非常少紅細(xì)胞沉降；

++：定義為凝集的紅細(xì)胞覆蓋孔底,但中央有少量紅細(xì)胞沉降成小圓點(diǎn)；

+：定義為紅細(xì)胞沉于孔底中央,但周?chē)杂猩⒃诘募t細(xì)胞凝集；

-：定義為紅細(xì)胞全部沉于孔底中央,但周?chē)鸁o(wú)散在的紅細(xì)胞凝集.

2 結(jié)果與分析

2.1 HA蛋白胞外段軟件預(yù)測(cè)結(jié)果

HA蛋白胞外段的預(yù)測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1.圖1中HA第17-532位氨基酸為胞外段,可以行使全蛋白功能,作為表達(dá)的目標(biāo)片段.

圖1 HA胞外段預(yù)測(cè)

2.2 重組載體的酶切鑒定結(jié)果

根據(jù)HA序列合成引物,將目的片段克隆至特定載體中用于蛋白表達(dá).重組HA和HA1基因克隆及重組質(zhì)粒酶切鑒定圖見(jiàn)圖2.

圖2 重組HA和HA1基因克隆及重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果

由圖1.2可知,HA和HA1都已成功構(gòu)建到pET42a質(zhì)粒,經(jīng)測(cè)序確定序列無(wú)誤后,分別轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌,用于后續(xù)原核蛋白表達(dá).HA基因片段位于1 548 bp區(qū)域,HA1基因片段位于1 000 bp區(qū)域.

2.3 原核HA蛋白的鑒定

原核重組HA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3.

圖3 原核重組HA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE鑒定

由圖3可見(jiàn),原核HA重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)小量誘導(dǎo)表達(dá)驗(yàn)證,HA和HA1蛋白均表達(dá)在菌體中.通過(guò)包涵體純化并復(fù)性的方法將原核表達(dá)HA和HA1蛋白純化出來(lái).

原核表達(dá)重組HA和HA1的Western-blotting鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4.

圖4 原核表達(dá)重組HA和HA1的Western-blotting鑒定

由圖4可知,在HA和HA1蛋白區(qū)域均能雜出特異性條帶.

2.4 HA蛋白的血凝試驗(yàn)

使用雞、人、小鼠3種不同紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖5.

圖5 HA蛋白的血凝試驗(yàn)

由圖5可見(jiàn),使用雞、人、小鼠3種不同紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn),這些HA蛋白均發(fā)生血凝作用.但不同HA對(duì)不同來(lái)源血細(xì)胞的血凝結(jié)果不同.不同HA對(duì)不同來(lái)源血細(xì)胞的血凝效價(jià)見(jiàn)圖6.

圖6 HA血凝效價(jià)

由圖6可見(jiàn),QH-HA對(duì)人紅細(xì)胞的凝集效果較對(duì)雞紅細(xì)胞好,AH-HA和HK-HA對(duì)雞紅細(xì)胞的凝集效果較對(duì)人紅細(xì)胞好,而對(duì)小鼠紅細(xì)胞,這些HA都有較高的血凝效價(jià).因?yàn)镠A結(jié)合紅細(xì)胞表面的唾液酸受體而形成凝集反應(yīng),提示不同分枝的HA對(duì)不同物種唾液酸受體有不同的親和性.

3 討論

高致病性禽流感病毒H5N1血凝素（HA）蛋白是病毒結(jié)合宿主細(xì)胞受體的重要分子,是機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要靶抗原,因此HA也成為研制疫苗的主要靶點(diǎn).HA蛋白的高度變異是病毒逃逸宿主免疫防御的主要方式,目前還沒(méi)有哪種疫苗能夠產(chǎn)生廣譜和持久的保護(hù)效力[3-4].

1997 年首例人感高致病性禽流感病例在香港被發(fā)現(xiàn),防范H5N1跨物種傳播在人群中大爆發(fā)成為世界研究的重點(diǎn).中國(guó)作為最大的農(nóng)業(yè)國(guó),擁有世界五分之一的人口,在防止禽流感擴(kuò)散方面具有重要的戰(zhàn)略地位.目前,據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示中國(guó)已有感染病例30例,死亡20例.研制和發(fā)展一種高效的保護(hù)性疫苗成為中國(guó)防治人感禽流感的首要任務(wù)[5].

血凝素HA蛋白是禽流感病毒產(chǎn)生中和抗體和疫苗研制的重要靶蛋白,因其高度變異性,造成病毒的免疫逃逸和疫苗的失效.具有生物學(xué)功能的HA蛋白由HA1和HA2兩個(gè)亞單位通過(guò)二硫鍵連接而成.HA1亞單位中的受體結(jié)合區(qū)域（receptor binding domain,RBD）是結(jié)合宿主細(xì)胞的主要部位,也是HA蛋白突變的高發(fā)部位.在RBD結(jié)構(gòu)域周?chē)潜容^保守的HA序列,不同毒株的H5N1HA蛋白序列相似度高達(dá)93%.因此,HA蛋白成為研制新型流感疫苗的重要靶標(biāo)[6-7].

HA蛋白表達(dá)已經(jīng)比較成熟[8-9].本研究通過(guò)基因重組方法,利用表達(dá)載體pET42a成功表達(dá)了AIV-H5亞型的HA基因,為進(jìn)一步利用重組蛋白研制AIV-H5抗體的ELISA檢測(cè)方法,研制抗AIV-H5亞型的單克隆抗體提供了基礎(chǔ).本研究中原核表達(dá)的HA蛋白也具有血凝活性,HA蛋白是糖蛋白,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)會(huì)加重其糖基化,有可能導(dǎo)致其血凝活性喪失,而原核系統(tǒng)缺少糖基化作用,可以減少多糖基化對(duì)HA蛋白的影響,其血凝活性得以保持.本研究的結(jié)果顯示HA蛋白可以在原核細(xì)胞中表達(dá)并具有血凝活性.

[1]Baigent SJ,McCauleyJ W.Influenza type Ain humans,mammals and birds：determinants ofvirulence,host-range and interspecies transmission[J].Boiessays,2003,25：657-671.

[2]陳一兵,劉岳龍,霍金富.禽流感血凝素糖蛋白（HA）的結(jié)構(gòu)及其功能[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2004,25（6）：4-6.

[3]Li Z,Ma C,Liu Z,et al.Serologic cross-reactivity among humans and birds infected with highly pathogenic avian influenza A subtype H5N1 viruses in China[J].ImmunologyLetters 2011,135（1/2）：59-63.

[4]Li Z,Liu Z H,Ma C,et al.Identification of amino acids in highly pathogenic avian influenza H5N1 virus hemagglutinin that determine avian influenza species specificity[J].Archives ofVirology,2011,156（10）：1803-1812.

[5]李崢,何維.流感與禽流感研究進(jìn)展[J].國(guó)際病毒學(xué)雜志,2008,15（4）：97-100.

[6]James S,Ola B,Terrence M T,et al.Structure and receptor specificity of the hemagglutinin from an H5N1 influenza virus[J].Science,2006,312：404-410.

[7]Aarthi C,Aravind S,Rahul R,et al.Glycan topology determines human adaptation of avian H5N1 virus hemagglutinin[J].Nature Biotechnology,2008,26：107-113.

[8]WangKY,Kathleen MH,Karl A,et al.Expression and purification ofan influenza hemagglutinin：one step closer toa recombinant protein-based influenza vaccine[J].Vaccine,2006,24（12）：2176-2185.

[9]李清州,郝惠芳,王麗,等.H5N1亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因的表達(dá)及純化[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2008（8）：127-130.