蘇晴,秦志英,程威,李友勇

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

BNS是新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)對(duì)溫度敏感的小麥雄性不育系,有良好的不育性和恢復(fù)性,被認(rèn)為在雜交小麥研究和利用中有重要價(jià)值[1].關(guān)于BNS不育機(jī)制研究,在感溫時(shí)期、轉(zhuǎn)換溫度、花粉育性等方面已有重要結(jié)果[1-3],但這些結(jié)果多屬個(gè)體形態(tài)和生育期指標(biāo),在小孢子發(fā)育和花粉形成過程中小孢子形態(tài)結(jié)構(gòu)改變方面尚未見報(bào)道.植物雄性不育發(fā)生實(shí)際上是小孢子的敗育過程,這個(gè)過程的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)不育機(jī)制分析、不育類型判別、敗育時(shí)期確定等有重要參考價(jià)值.本文以BNS型雄性不育系和它的轉(zhuǎn)換系,以及與恢復(fù)系雜交的F1代為材料,在細(xì)胞學(xué)角度系統(tǒng)觀察從四分體形成到花粉成熟期間小孢子發(fā)育過程和花粉形成過程的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化,探討B(tài)NS小孢子敗育時(shí)期、敗育類型和敗育特征.

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

BNS不育系由河南科技學(xué)院小麥中心提供,F1組合為“BNS×YN0601”.10月1日播種的BNS為雄性不育系；該BNS種子在11月3日播種即為可育的轉(zhuǎn)換系；F1在10月1日與BNS不育系同期播種.

1.2 試驗(yàn)方法

取材：觀察材料取外部形態(tài)較典型的5個(gè)時(shí)期,分別是旗葉與倒二葉葉枕距0～2、2～4、4～8 cm,穗從旗葉抽出一半時(shí)期（也叫“露臉期”或“抽穗期”）和穗完全抽出后1～2 d,對(duì)應(yīng)的小孢子發(fā)育時(shí)期分別是四分體期、單核早中期、單核晚期、二核期和花粉成熟期.

觀察：取材后立即固定在卡諾氏液（冰醋酸1份+無水乙醇3份）中,24 h后95%乙醇和75%乙醇分別換洗1 h,75%乙醇保存.取該固定材料或新鮮材料的中部第1小花3枚花藥,醋酸洋紅染色,花粉母細(xì)胞涂片法制片,在顯微鏡下觀察小孢子發(fā)育時(shí)期并用CanonPC1019拍攝照片.

花粉敗育率統(tǒng)計(jì)：近成熟花粉用I2-KI染色,選擇3個(gè)以上小穗花藥的花粉粒集中的視野,計(jì)數(shù)不育和可育花粉,統(tǒng)計(jì)花粉敗育率,花粉敗育率=（不育花粉粒數(shù)/總花粉粒數(shù)）×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 花藥形態(tài)

5個(gè)時(shí)期花藥典型形態(tài)見圖1.

圖1 BNS不育系和它的轉(zhuǎn)換系及與恢復(fù)系雜交F1的花藥5個(gè)時(shí)期（四分體時(shí)期、單核早中期、單核靠邊期、二核期和成熟期）的花藥發(fā)育形態(tài)

2.2 小孢子發(fā)育的形態(tài)與結(jié)構(gòu)

BNS不育系、轉(zhuǎn)換系以及雜交的F1的小孢子發(fā)育過程及結(jié)構(gòu)特征見圖2.

注：A- 不育系；B-F1；C- 轉(zhuǎn)換系.A1、B1、C1 是四分體期,顯示四分體正常；A2、B2、C2 顯示單核靠邊期小孢子正常；A3、B3、C3和A4、B4、C4是第一次核分裂期和二核期花粉,顯示出正常結(jié)構(gòu)；A5顯示典型不育花粉,但有極少數(shù)可育花粉；C5中部分花粉轉(zhuǎn)換為可育；B5是F1的花粉,近于完全可育.

由圖2可以看出：

（1）單核期之前BNS小孢子的發(fā)育是正常的.BNS不育系與轉(zhuǎn)換系以及雜交的F1的四分體構(gòu)象是一致的（圖2 A1、B1、C1）,在BNS不育系中沒有發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象,并且觀察發(fā)現(xiàn),多數(shù)小孢子能進(jìn)入第一次核分裂期（圖2 A3）,也有相當(dāng)比例的小孢子能進(jìn)入二核期.這說明BNS不育系形態(tài)結(jié)構(gòu)在二核期前的發(fā)育是正常的,二核期后在結(jié)構(gòu)上開始退化.二核期對(duì)應(yīng)的外部形態(tài)為穗打苞期,或穗剛“露臉”的抽穗期.

（2）二核期形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯異常.二核后期雖然在小孢子中仍然觀察到有二核或三核形態(tài),但發(fā)育逐漸停滯.表現(xiàn)特征為小孢子細(xì)胞質(zhì)團(tuán)變小,核染色變淺,部分小孢子核模糊并逐漸消失（圖3 D1-D5）.由于此期淀粉開始合成,因此停滯的早晚,在碘染上反映出來的是染色淺或深.小麥“露臉”到穗抽出約經(jīng)歷2～3 d,抽穗到揚(yáng)花約6～8 d,BNS花粉大部分是完全不育的,這說明BNS不育集中發(fā)生在進(jìn)入二核期及以后,外部形態(tài)在打苞到抽穗后3～4 d.

圖3 BNS不育系小孢子的敗育形態(tài)

（3）3個(gè)系花粉發(fā)育特征差異明顯.從圖2和表1可看出,F1花粉碘染色充分,花粉幾乎全部可育,花粉可育率平均達(dá)93%以上.不育系的花粉中,多數(shù)視野的花粉是全不育的,但也有部分視野中有比例不等的可育花粉出現(xiàn)（見圖2 A5）,分布在0～3%之間.轉(zhuǎn)換系的可育花粉比例比不育系大為提高,觀察計(jì)數(shù)在50%～70%.另外,在不育系和轉(zhuǎn)換系中都可觀察到相當(dāng)比例的花粉有少許染色,即“染敗”和“園敗”.這些現(xiàn)象說明,不育系部分花粉能發(fā)育到充實(shí)淀粉時(shí)期,但后來停止了,有少數(shù)花粉能完成發(fā)育,這也證明BNS不育是一個(gè)持續(xù)過程,花粉敗育非同步.

表1 BNS不育系、轉(zhuǎn)換系及F1的花粉發(fā)育類型統(tǒng)計(jì)

3 討論

3.1 BNS花粉敗育在二核到三核期

植物雄性不育的發(fā)生,在分子代謝水平上被認(rèn)為是一個(gè)細(xì)胞程序性死亡的過程[4],這個(gè)過程應(yīng)該從感溫期開始,逐步影響到基因表達(dá)和代謝異常,繼而結(jié)構(gòu)異常、形態(tài)異常.BNS對(duì)溫度敏感時(shí)期認(rèn)為是減數(shù)分裂期[2],也有認(rèn)為是雌雄蕊分化期即開始[1],但在結(jié)構(gòu)和形態(tài)特征上,從本試驗(yàn)觀察結(jié)果看是從單核后期開始,二核期有明顯結(jié)構(gòu)異常,大量敗育.BNS小孢子的敗育過程和時(shí)期與ES光溫敏小麥雄性不育的敗育特征相近[5],外部形態(tài)是抽穗期的打苞和“露臉”,持續(xù)5～6 d,直到揚(yáng)花.

3.2 BNS不育屬孢子體不育和花粉敗育型

小麥雄性不育類型按基因控制類型分為孢子體不育、配子體不育、雄花分化失敗不育和混合不育等[6].BNS的花藥結(jié)構(gòu)分化正常,小孢子在不育系中敗育,在F1中完全正常發(fā)育,該特征說明BNS屬孢子體不育,個(gè)體的可育基因完全能使花藥正常發(fā)育,花粉正常形成.根據(jù)小孢子敗育發(fā)生時(shí)期及特征,小麥雄性不育又可分為無花粉型和花粉敗育型[7],BNS敗育發(fā)生在二核至三核期,因此屬于花粉敗育類型.

3.3 BNS不育基因是非絕對(duì)基因效應(yīng)控制

在結(jié)果中觀察到的BNS不育系花藥中有少量可育花粉形成,對(duì)應(yīng)的是在轉(zhuǎn)換系中,也有相當(dāng)比例小孢子不能發(fā)育成正?；ǚ?這種現(xiàn)象說明,BNS不育基因是以一種非絕對(duì)基因效應(yīng)方式影響到花粉發(fā)育.這種效應(yīng)有兩種表現(xiàn)形式,一是小孢子敗育的“非同步性”,即不育花粉有典敗,也有園敗和染敗,溫度升高,典敗、園敗比例降低,染敗、正?；ǚ郾壤撸欢荁NS在不育期內(nèi),游離后的小孢子,有可能少數(shù)發(fā)育到成熟,盡管結(jié)實(shí)率為零,該類不結(jié)實(shí)是由于花藥不開裂的緣故.BNS的這種非絕對(duì)基因效應(yīng)現(xiàn)象在水稻中也有發(fā)現(xiàn),張銳等在光敏核不育水稻研究中也發(fā)現(xiàn)光或溫度的變化對(duì)不育基因不能起到完全的“開關(guān)”作用[8].不育基因的非絕對(duì)基因效應(yīng)在BNS中有兩個(gè)意義,其一是溫度對(duì)基因的作用有累加性,在溫度敏感期,溫度越高,可育程度越高,反之愈低；其二,不育基因作用有器官和發(fā)育時(shí)期特異性,在BNS中,該特異性在小孢子游離后發(fā)生,這是配子體世代基因程序性表達(dá)的結(jié)果.BNS不育基因的這種非絕對(duì)基因效應(yīng)本質(zhì),尚需從分子代謝水平解釋.

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