方 文,肖靚靚,包懷恩,牟 榮

2.貴陽醫(yī)學(xué)院寄生蟲學(xué)教研室,貴陽 550004

豬帶絳蟲病是在世界范圍內(nèi)流行、危害人類健康的腸道蠕蟲病之一,而其幼蟲除了可寄生于中間宿主豬外,還可寄生于人體,引起嚴(yán)重的囊尾蚴病[1],不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失,而且給人民健康帶來嚴(yán)重威脅。因此積極開展對豬帶絳蟲的研究并控制其感染和流行具有重要意義。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase,GST)廣泛存在于多種生物體內(nèi),對機(jī)體具有重要的解毒和保護(hù)作用。迄今為止,在所有已研究過的蠕蟲中均證實有GST表達(dá),并證實GST在蠕蟲抵抗宿主免疫攻擊中起重要作用[2]。本研究應(yīng)用免疫組化、雙向電泳結(jié)合蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析豬囊尾蚴GST的表達(dá),為篩選豬帶絳蟲保護(hù)性抗原及可能的治療靶分子提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 GST免疫組化試劑盒(北京中杉生物技術(shù)有限公司)、固相pH梯度(immobilized pH gradient,IPG)干膠條(pH 3～10,7 cm)、IPG 緩沖液(pH 3～10)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(T ris)、二硫蘇糖醇(DTT)、硫脲(Thioourea)、十二烷基硫酸納(SDS),超純脲(ultra urea)、四甲基乙二胺(T EMED)、丙基硫酸鹽(CHAPS)、碘乙酰胺(iodoacetamide)、蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Cocktail)、核酸酶(Dnase和Rnase)等(美國General Electric公司),低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(北京天根生化科技有限公司),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗大鼠IgG(HRP-IgG)(北京索來寶生物技術(shù)有限公司),聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)及化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 實驗蟲體的來源及蟲卵懸液的制備 豬帶絳蟲成蟲,采自四川省雅江縣呷拉鄉(xiāng)豬帶絳蟲病患者(女性,28歲,自訴經(jīng)常肚子痛,有排節(jié)片史,喜食生臘肉),口服檳榔-南瓜子驅(qū)蟲[3],新鮮蟲體用0.9%生理鹽水浸泡保存。蟲體孕節(jié)及頭節(jié)用卡紅染色,制作壓片,經(jīng)顯微鏡觀察證實為豬帶絳蟲成蟲。挑開豬帶絳蟲后段全部孕節(jié)的子宮,用生理鹽水沖洗子宮數(shù)次使蟲卵溢出,收集全部沖洗液,3 000 r/min離心15 min,收集沉淀的蟲卵。取蟲卵懸液1mL進(jìn)行膽汁孵育試驗,用臺盼藍(lán)染色計數(shù)六鉤蚴法[4]檢測蟲卵存活率為 80%。取蟲卵懸液0.1mL,光鏡下計數(shù)蟲卵(重復(fù)操作6次,取平均值),計算蟲卵總數(shù)。用生理鹽水稀釋蟲卵懸液濃度約10萬個/mL,其中的存活蟲卵數(shù)約為8萬個/mL(10萬×80%)。

1.2.2 實驗動物感染 20d齡三元雜交乳豬6頭,體重6.5～7kg,由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物養(yǎng)殖中心提供,經(jīng)糞檢和間接血凝實驗(IHA)證實,無豬囊尾蚴及其他寄生蟲感染。將每頭豬灌胃1mL蟲卵(8萬個/mL)。乳豬以專用膨化顆粒飼料飼養(yǎng),隔離圈養(yǎng)于清潔水泥地面飼養(yǎng)宅內(nèi),防止自然感染。

1.2.3 免疫組化 在第40d、80d和120d天各宰殺2頭豬。取含豬囊尾蚴的肝臟(120 d除外)和肌肉組織1.0×1.0×0.5cm3各數(shù)塊,置于10%福爾馬林中4℃冰箱過夜。常規(guī)脫水,石蠟包埋,4μ m 連續(xù)切片。切片經(jīng)脫蠟、脫苯、水化后,置于 pH 6.0枸櫞酸緩沖液中用高壓鍋進(jìn)行抗原修復(fù)2min,PBS洗滌3次,分別滴加單克隆抗體GST(1∶300),置于4℃冰箱內(nèi)過夜,PBS洗滌后滴加二抗孵育30min,然后常規(guī)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、封片。陰性對照用PBS液代替一抗。

1.2.4 數(shù)據(jù)測量及顯微攝影 將上述免疫組化切片每組隨機(jī)選取10張,每張切片在囊尾蚴囊壁及頭節(jié)隨機(jī)選取5個視場,每個視場選取5個陽性表達(dá)區(qū)域用Mias圖像分析處理系統(tǒng)測量平均光密度(平均光密度為測量薄層斑點透射光強(qiáng)度大小,平均光密度值越大,標(biāo)本染色越淺)。日本NIKON光學(xué)顯微攝影裝置拍照。

1.2.6 豬囊尾蚴蛋白的制備 取感染后40d寄生在肌肉的豬囊尾蚴50 mg,用1 mL裂解液[含7 mol/L超純脲(ultraurea),2 mol/L硫脲(Thiourea),4%丙基硫酸鹽(CHAPS),40 mmol/L二硫蘇糖醇(DT T),2%pH 3～10固相pH 梯度(IPG)緩沖液],臨用前加1%復(fù)合蛋白酶抑制劑(Protease Inhibitor Mix)冰浴勻漿,分裝于1.5 mL離心管,加20μ g/mL脫氧核糖核酸酶(Dnase)和 5μ g/mL核糖核酸酶(RNase)置4℃15 min,于4℃40 000×g離心1 h,收集上清,用雙向電泳沉淀劑(2D cleanup)試劑盒處理。考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)測定蛋白濃度,分裝,-80℃保存。

1.2.7 豬囊尾蚴蛋白雙向電泳分析 豬囊尾蚴總蛋白溶液于4℃融化、8 000×g離心10 min。加入上樣緩沖液(7mol/L ultraurea、2 mol/L T hiourea、2%CHAPS、65mmol/L DTT、0.5%pH 3 ～ 10 IPG緩沖液和痕量溴酚藍(lán)),每膠條上樣300μ g(體積為 125μ L),將兩根 IPG膠條(7cm)分別置于溶脹槽中重泡脹至少12 h,再轉(zhuǎn)入等電聚焦儀(型號為Ettan IPGphorⅢ ,美國 General Electric公司)進(jìn)行第一向等電聚焦(依次為250 V 40 min,500 V 40 min,4000 V 3 h,4000 V 20000 Vh)。膠條經(jīng)兩次平衡后進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),其中的一塊膠為制備膠,另一塊膠用于蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)分析。制備膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色,用掃描儀(型號為UNISCAN e100,中國清華紫光股份有限公司)進(jìn)行透射掃描,用雙向電泳圖像分析軟件(ImageMaster 2D platinum 5.0)對圖像進(jìn)行強(qiáng)度校正、點檢測、背景消減和點匹配等。用二維校正法確定蛋白質(zhì)等電點(pI)和相對分子質(zhì)量(Mr)。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡(Western-blotting)分析 采用半干轉(zhuǎn)膜技術(shù)(參照TE77 PWR半干轉(zhuǎn)儀器說明書)將雙向電泳凝膠蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜(與凝膠同樣大小)(1.0 mA/cm2室溫轉(zhuǎn)移1.0 h)。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,TBST(含20 mmol/L Tris·HCl pH 7.6,140 mmol/L NaCl和0.1%Tween20)洗3次(10 min/次,下同)。實驗組一抗為本課題組自制大鼠抗豬帶絳蟲GST血清[5](1∶100)、對照組一抗為正常大鼠血清(1∶100)室溫孵育3 h,TBST洗膜3次。二抗為羊抗大鼠HRP-IgG(1∶200)室溫孵育2 h,TBST洗膜 3次。干燥1～2 min。在暗室將膠片剪成與PVDF膜同樣大小,用化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(產(chǎn)品編號:EK1004,中國武漢博士德生物工程有限公司)將PVDF膜進(jìn)行膠片曝光顯影、定影,流水沖洗、干燥,掃描保存雜交圖像。比較兩組雜交蛋白點的差異,確定豬囊尾蚴GST抗原抗體陽性雜交斑點。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化觀察 GST陽性表達(dá)主要定位于豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁細(xì)胞的胞漿,呈棕黃色顆粒,見圖1。不同時期寄生在肝臟及肌肉的豬囊尾蚴均表達(dá)GST,隨感染時間增加,寄生在肌肉的豬囊尾蚴GST的表達(dá)變化不大(P＞0.05),寄生在肝臟的豬囊尾蚴GST的表達(dá)升高(P ＜0.05),見表1。

圖1 豬囊尾蚴GST的表達(dá)1.1陰性對照(感染40d寄生在肌肉的豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁胞漿處未見GST棕黃色顆粒)(×100);1.2感染80d的豬囊尾蚴囊壁及鄰近肌肉組織胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×200);1.3感染120d寄生在肌肉的豬囊尾蚴頭節(jié)胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×100);1.4感染40d的豬囊尾蚴囊壁及鄰近肝組織胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×200);1.5感染80d的豬囊尾蚴囊壁及鄰近肝組織胞漿處可見GST棕黃色顆粒(×200)Fig.1 GST expression on cysticercus cellulosae1.1 Negative control(None GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae parasitizedin muscle 40 days after infection)(×100);1.2 GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae and the adjacent muscle 80 days after infection(×200)1.3 GST brown granules could be seen in the head of cysticercus cellulosae parasitizedin muscle 120 days after infection(×100);1.4 GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae and the adjacent liver 40 days after infection(×200);1.5 GST brown granules could be seen in cysticercus cellulosae and the adjacent liver 80 days after infection(×200)

2.2 豬囊尾蚴蛋白雙向電泳 3塊制備膠經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色后用掃描儀獲取圖像,再用雙向電泳圖像分析軟件進(jìn)行分析,結(jié)果表明蛋白斑點數(shù)為207±9,相對分子質(zhì)量(Mr)為 14 400～94 000,等電點(pI)為3.0～10.0。其中153±4個蛋白斑點的 pI為4.0～7.0,在極酸性(pH 3)和極堿性(pH 10)區(qū)域也出現(xiàn)少量蛋白斑點,見圖2。

2.3 豬囊尾蚴GST的Western-blotting分析 結(jié)果顯示,豬囊尾蚴GST抗原抗體陽性雜交斑點為1個,陰性對照未見抗原抗體陽性雜交斑點,見圖3。將Western-blotting檢測的抗原抗體陽性雜交斑點與原雙向電泳凝膠斑點進(jìn)行比對,找到對應(yīng)蛋白斑點,經(jīng)ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析后初步確定該蛋白斑點的pI/Mr為(6.6/25 548),與豬帶絳蟲GST的pI/Mr理論推導(dǎo)值接近。

表1 不同時期和寄生部位豬囊尾蚴GST表達(dá)的平均光密度值( ±s)Table 1 GST average value of optical densityon cysticercuscellulosae parasited in different tissuesat different times

表1 不同時期和寄生部位豬囊尾蚴GST表達(dá)的平均光密度值( ±s)Table 1 GST average value of optical densityon cysticercuscellulosae parasited in different tissuesat different times

*:表示和同組40d比較,P＜0.05.

部位 40d 80d 120d肝臟 179.84±6.59 171.73±6.82* 0對照組 198.54±5.82 201.46±2.19 0肌肉 183.22±7.11 181.95±6.36 184.12±5.47對照組 201.43±1.59 201.54±4.21 201.83±2.35

3 討 論

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-ransferases,GST)從原蟲到脊椎動物廣泛存在,是由多個基因編碼、具有多種功能的超家族酶。它能使外源性或內(nèi)源性的毒素分子失活而轉(zhuǎn)變?yōu)樗苄曰衔镆赃_(dá)到初步解毒的作用,因而是多種生物體內(nèi)主要的Ⅱ相解毒系統(tǒng),與許多生理及異源物質(zhì)的排泄有關(guān)[6-7]。

Brophy等[2]報道在所有蠕蟲成蟲的體內(nèi)均存在有活性的GST,且GST多存在于蟲體細(xì)胞的胞質(zhì)中,是蠕蟲主要解毒酶之一。方強(qiáng)[8]等用GST底物催化法檢測寄生在肌肉的成熟、未成熟豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁勻漿的GST活性,發(fā)現(xiàn)豬囊尾蚴頭節(jié)及囊壁內(nèi)存在相同的GST活性,且GST活性與豬囊尾蚴的成熟程度無關(guān)。

本研究結(jié)果顯示:不同時期寄生在肝臟及肌肉的豬囊尾蚴均表達(dá)GST,隨感染時間增加,寄生在肌肉的豬囊尾蚴GST的表達(dá)變化不大(P＞0.05),寄生在肝臟的豬囊尾蚴(120d除外)GST的表達(dá)升高(P＜0.05)。病理觀察肝臟炎癥反應(yīng)也隨感染時間延長而加重,可能由于肝臟血供豐富,抗體較其他器官集中,宿主對囊尾蚴產(chǎn)生強(qiáng)烈的炎癥病理反應(yīng),可是早期豬囊尾蚴依然存活下來繼續(xù)生長,推測GST的表達(dá)在一定程度上對豬囊尾蚴在宿主中的生存起到保護(hù)作用,隨感染時間增加GST分泌增多,直到后期(120d)豬囊尾蚴才出現(xiàn)壞死和鈣化,推測是由于肝臟中宿主免疫效應(yīng)逐漸增強(qiáng),豬囊尾蚴自身保護(hù)機(jī)制與宿主免疫殺傷作用抗?fàn)幍慕Y(jié)果。

本研究首次運(yùn)用雙向電泳結(jié)合western-blotting技術(shù)分析豬囊尾蚴GST的表達(dá)。蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)應(yīng)用于帶絳蟲的研究報道不多,僅見少量豬帶絳蟲蛋白質(zhì)組的研究報道[9-11],本研究首次運(yùn)用雙向電泳技術(shù)獲得豬囊尾蚴的總蛋白圖譜,并用本課題組自制的大鼠抗豬帶絳蟲GST血清[5]作蛋白質(zhì)印跡反應(yīng),得到1個特異性抗原抗體陽性雜交斑點,陰性對照未見陽性雜交斑點。將 Western blotting檢測的抗原抗體陽性雜交斑點與原雙向電泳凝膠斑點比對后找到對應(yīng)蛋白斑點,經(jīng) ImageMaster 2D Platinum 5.0軟件分析后初步確定該蛋白斑點的pI/Mr為6.5/25 548,與豬帶絳蟲GST的pI/Mr理論推導(dǎo)值接近[12]。

如今 ,GST作為較強(qiáng)保護(hù)性抗原、有效的降低機(jī)體蟲荷和排泄物蟲卵的數(shù)量及影響成蟲生殖能力的特點逐漸被學(xué)術(shù)界認(rèn)同。同時,GST還是抗惡性瘧原蟲潛在的藥物靶標(biāo)[13],也是免疫化學(xué)方法抗蠕蟲的潛在標(biāo)靶,是WHO提出的6個最具有潛力的候選疫苗分子之一[14-15]。本研究揭示不同時期和寄生部位豬囊尾蚴GST的表達(dá)情況,這對開發(fā)相關(guān)疫苗及可能的治療靶分子,實現(xiàn)對寄生蟲數(shù)量和分布的控制會起到積極作用,從而為畜牧業(yè)生產(chǎn)及人類健康服務(wù)。

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