張曉波，趙 艷

（1.海南大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，山西 太谷 030801）

聯(lián)合固氮是自由生活的固氮菌定殖于植物根際土壤中形成的特殊固氮作用，它們對(duì)植物生長(zhǎng)有著一定的促進(jìn)作用［1］。目前，水稻、玉米等禾本科作物根際固氮菌的研究較深入［2－13］，對(duì)于禾本科牧草固氮菌的研究較少。而近年來(lái)，草坪業(yè)在我國(guó)作為新興產(chǎn)業(yè)，其發(fā)展速度日新月異，但化肥的大量使用嚴(yán)重影響了土壤結(jié)構(gòu)，破壞了土壤的生態(tài)平衡，而固氮菌可以為作物提供氮素營(yíng)養(yǎng)，并對(duì)促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)再循環(huán)，維持生物圈的正常功能起著重要作用。因此，固氮菌肥料在這一領(lǐng)域?qū)?huì)有廣大的前景。

試驗(yàn)對(duì)結(jié)縷草（Zoysia japonica）根際土壤中分離到的5株固氮菌菌株的最適溫度、最適pH值以及最佳通氣量等條件進(jìn)行研究，在上述基礎(chǔ)上測(cè)定各個(gè)菌株的典型生長(zhǎng)曲線，這些數(shù)據(jù)對(duì)有效地利用和促進(jìn)菌株生長(zhǎng)具有重要現(xiàn)實(shí)意義，可為生物菌肥的研制及禾本科植物菌肥的使用提供必要的理論數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試菌株為從海南大學(xué)校內(nèi)結(jié)縷草草坪根際土壤中分離、純化，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定及固氮酶活性測(cè)定篩選得到的高效固氮菌株，菌株標(biāo)記為N1、N4、N5、N6、N8共5株，供試菌株的鑒定已在《草原與草坪》2011年第1期上發(fā)表，見(jiàn)參考文獻(xiàn)［14］，其固氮酶活性為194.5C2H4nmol/（mL·h）（N8）～215.4C2H4nmol/（mL·h）（N1）。

培養(yǎng)基為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基［15］。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)均以未接菌的LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.2.1 溫度條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 按2%接種量分別將菌株接種到LB液體試管培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種接種4管，分別于10、15、20、25、30、35、40、45℃振蕩培養(yǎng)（180r/min）48h，然后測(cè)定每個(gè)菌株的OD600nm吸光值，并計(jì)算平均值，以確定各菌株的最適生長(zhǎng)溫度。以O(shè)D600nm吸光值為縱坐標(biāo)，溫度為橫坐標(biāo)，生成坐標(biāo)圖。

1.2.2 初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 將菌株按2%接種量分別接種到pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的LB液體試管培養(yǎng)基中，每個(gè)菌種接種4管，置于180r/min 28℃的振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后測(cè)定其OD600nm的平均吸光值，確定每種菌株的最適生長(zhǎng)pH值。以O(shè)D600nm吸光值為縱坐標(biāo)，pH為橫坐標(biāo)，生成坐標(biāo)圖。

1.2.3 通氣條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響 將菌株按5%的接種量接種到裝液量為30、50、100、150和180mL的三角瓶（250mL）中，28℃振蕩培養(yǎng)（180r/min）48h后測(cè)定OD600nm的平均吸光值。確定每種菌株的最佳需氧量。以O(shè)D600nm吸光值為縱坐標(biāo)，通氣量梯度為橫坐標(biāo)，生成坐標(biāo)圖。

1.3 典型生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將各菌株分別從保存的試管斜面上取一環(huán)接種于10mL液體LB培養(yǎng)基中，于28℃，150r/min振蕩培養(yǎng)12h作為種子液。

按2%的接種量將種子液接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，以每支10mL分裝于標(biāo)記為0、2、4、6、8、10、12…24h的13支試管中，于每個(gè)菌株的最適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。按標(biāo)記時(shí)間從上述試管中各吸取l mL培養(yǎng)液，加入9mL滅菌生理鹽水，混勻后取出1mL加入下一支9mL無(wú)菌的生理鹽水中，依次類推，對(duì)菌液作10倍梯度稀釋，稀釋度為10－1、10－2、10－3直到10－10，分別吸取各稀釋度菌液0.1mL涂布LB平板，3次重復(fù)，于每個(gè)菌株的最適溫度培養(yǎng)48h。計(jì)數(shù)菌液不同稀釋度的3次重復(fù)的菌落數(shù)，菌落數(shù)在30～300的為有效平板，求其平均值。計(jì)算出供試菌株各生長(zhǎng)時(shí)間的菌數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

5株固氮菌株在10～45℃的溫度均能生長(zhǎng)（圖1），最適宜的生長(zhǎng)溫度為20～30℃，菌株的最適溫度存在差異，即菌株N1在30℃時(shí)，菌株N4、N6、N8在25℃時(shí)，菌株N05在20℃時(shí)，對(duì)應(yīng)其最高的OD600nm吸光值達(dá)到顯著水平（P＜0.05），OD600nm吸光值最高，即該溫度分別對(duì)應(yīng)各菌株的最適生長(zhǎng)溫度。

圖1 溫度條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.1 The effect of temperature on growth of strains

2.2 初始pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

從結(jié)縷草根際土壤中分離到的5株固氮菌株均能在pH 4.0～9.0生長(zhǎng)，表明這些菌株對(duì)pH具有相對(duì)較廣的適應(yīng)能力。各菌株的最適pH存在差異，即菌株 N1、N4、N6、N8最適初始pH 為7.0，N5為7.5吸光值達(dá)到顯著水平（P＜0.05），說(shuō)明這5個(gè)菌株在初始中性或稍偏堿性的條件下生長(zhǎng)較好。

圖2 pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.2 The effect of pH on growth of strains

2.3 通氣條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

從圖3可以看出，根據(jù)試驗(yàn)中各菌株最適通氣量的測(cè)定，菌株 N04、N05、N06、N08通氣量為220mL時(shí)生長(zhǎng)最好（吸光值達(dá)到顯著水平，（P＜0.05），說(shuō)明越高的氧分壓越有利于菌株的生長(zhǎng)；菌株N1在通氣量為200mL時(shí)最適宜其生長(zhǎng)，吸光值達(dá)到顯著水平，（P＜0.05），但在通氣量為220mL時(shí)它們生長(zhǎng)受到一定的阻礙。

2.4 典型生長(zhǎng)曲線

由各個(gè)菌株的典型生長(zhǎng)曲線可以看出，N1、N6菌株經(jīng)過(guò)一個(gè)短暫的0～2h的延遲期，于2～14h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，穩(wěn)定期為14～18h，18h后進(jìn)入衰亡期；菌株N4、N5經(jīng)過(guò)0～2h的延遲期后，于2～16h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，16～20h進(jìn)入穩(wěn)定期，20h后進(jìn)入衰亡期；菌株N08經(jīng)過(guò)0～4h的延遲期后，于4～18h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18～20h進(jìn)入穩(wěn)定期，20h后進(jìn)入衰亡期。由以上分析可以看出，篩選到的菌株均具有比較明顯的延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期以及衰亡期。

圖3 通氣條件對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of oxygen conditions on growth of strains

圖4 菌株典型生長(zhǎng)曲線Fig.4 The typical growth curves of strains

3 討論與結(jié)論

（1）前人研究表明，微生物在人工培養(yǎng)時(shí)直接受溫度條件的影響，適宜的培養(yǎng)溫度對(duì)微生物生長(zhǎng)具有很大的促進(jìn)作用［16］。湯春梅［17］以甘肅省東祁連山高寒地區(qū)禾本科牧草根際分離、篩選獲得的固氮菌株N4、X5、C－6、Dry6為材料，對(duì)其所需培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明菌株X5、C－6最適溫度為30℃，Dry6最適溫度35℃，N4最適溫度25℃；張麗梅［18］對(duì)固氮菌株W12進(jìn)行培養(yǎng)條件研究，試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為30℃；試驗(yàn)中，菌株N1的最適溫度為30℃，與湯春梅［17］、張麗梅［18］研究的結(jié)果較為一致；菌株N4、N6、N8最適溫度為25℃，與湯春梅研究固氮菌株N4結(jié)果較為一致［17］。

（2）在微生物人工培養(yǎng)過(guò)程中，適合的初始pH值往往對(duì)該微生物本身及發(fā)酵生產(chǎn)在初期就產(chǎn)生促進(jìn)作用，對(duì)于某種有益特定微生物種類來(lái)說(shuō)，找到其發(fā)酵的最適初始pH值并應(yīng)用，是工業(yè)培養(yǎng)及發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中的一項(xiàng)重要措施之一。湯春梅［17］對(duì)固氮菌株N4、X5、C－6、Dry6進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，C－6初始pH 7.5時(shí)，X5初始pH 7.5～8.0時(shí)，N4、Dry6初始pH 8.0時(shí)，菌株的活菌數(shù)達(dá)最高。張麗梅［18］對(duì)固氮菌 W12菌株的研究結(jié)果則表明，最適初始pH為5.0～6.0。蔣瑋等［19］對(duì)固氮菌株HY1141進(jìn)行了最佳培養(yǎng)條件研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)基最適初始pH為7.0。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株N04最適初始pH為7.5，與湯春梅［17］研究的菌株C－6結(jié)果較為吻合；菌株N1、N5、N6、N8最適初始pH值為7.0，與蔣瑋等［19］研究結(jié)果較為吻合，而與湯春梅［17］、張麗梅［18］研究的結(jié)果有一定差異。

（3）微生物對(duì)氧的需要和耐受能力在不同的類群中差別很大，所以在微生物人工培養(yǎng)過(guò)程中，通氣量也是一個(gè)關(guān)鍵的影響因素。目前，固氮菌通氣量的研究較少，在此次研究中，菌株N4、N5、N6、N8最適通氣量為220mL，菌株N01最適通氣量為200mL。這些數(shù)據(jù)可以對(duì)將來(lái)菌株的生產(chǎn)發(fā)酵提供一定的指導(dǎo)。

（4）利用典型生長(zhǎng)曲線可以看出不同微生物在培養(yǎng)過(guò)程中進(jìn)入延遲期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期及衰亡期的時(shí)間，所以，根據(jù)典型生長(zhǎng)曲線可以明確微生物的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐具有重大的指導(dǎo)意義。有些學(xué)者已經(jīng)對(duì)一些特異微生物的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了初步的研究，如李木桂等［20］對(duì)篩選出的3株溶藻菌L7，L8和L18進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線的研究；陶令霞等［21］對(duì)固氮菌NT06的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行了測(cè)定，試驗(yàn)測(cè)定了從結(jié)縷草根際土壤中篩選的5株固氮菌的典型生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)除菌株N08（延遲期為0～4h）外，其余4個(gè)菌株延遲期均為0～2h，但進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期以后所持續(xù)的時(shí)間也有所不同，菌株N1、N6為2～14h；菌株N4、N5為2～16 h，相比N1、N6延長(zhǎng)了2h；相應(yīng)地，N4、N5進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間又比N1、N6推遲了2h（16～20h）；菌株N8于4～18h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，18～20h進(jìn)入穩(wěn)定期。菌株N1、N6 18h后進(jìn)入衰亡期，菌株N4、N5、N8 20h后進(jìn)入衰亡期。說(shuō)明不同菌株的生長(zhǎng)發(fā)育特性有一定的差異，這些數(shù)據(jù)對(duì)今后菌株的生產(chǎn)及利用具有重要意義。

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