賴?yán)棼?，趙 潔，張 博，王 濤

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 草地資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830052）

鹽分是影響植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的一個(gè)重要環(huán)境因子，根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究資料顯示，鹽脅迫對(duì)植物的生長(zhǎng)、水分關(guān)系、葉片解剖學(xué)、光合色素及蛋白、脂類、離子水平、抗氧化酶及抗氧化劑、氮素代謝、蘋果酸鹽代謝、葉綠體超微結(jié)構(gòu)以及光合作用的機(jī)制等方面都有重要的影響［1］。植物的耐鹽機(jī)制是一個(gè)非常復(fù)雜的問題，涉及到生理、生化和分子生物學(xué)等方面，各種途徑可能是單獨(dú)作用，也可能是協(xié)同作用［2］。隨著功能基因組學(xué)的發(fā)展，植物的耐鹽性研究已深入到耐鹽相關(guān)基因的克隆、基因的結(jié)構(gòu)分析以及基因表達(dá)特性等領(lǐng)域［3］。對(duì)于這些基因的表達(dá)方式及其在耐鹽反應(yīng)中的作用已逐步被了解，植物耐鹽性是由多基因控制的數(shù)量性狀。當(dāng)植物受到鹽脅迫后，一部分基因的表達(dá)量增加，協(xié)同完成脅迫的應(yīng)答，這類基因稱作鹽誘導(dǎo)基因［4］。目前，大 量的鹽誘導(dǎo)基因已經(jīng)在擬南芥［5］、截型苜蓿［6，7］、煙草［8］、小麥［9］、水稻［10］中分離克隆，并用于遺傳轉(zhuǎn)化。

基因芯片技術(shù)既可以高敏度的定量、定性檢測(cè)基因表達(dá)水平的差異，也能夠提供某一基因或基因群的表達(dá)模式與其他基因表達(dá)模式之間關(guān)聯(lián)的信息［11］。在小麥［12］和擬南芥［13］中，已經(jīng)利用cDNA 微陣列大規(guī)模地分析鹽脅迫相關(guān)基因表達(dá)譜。疏葉駱駝刺（Alhagi sparsifolia）是多年生豆科植物，具有很強(qiáng)的抗旱、抗霜凍、耐鹽堿能力［13－15］，與基因組序列測(cè)定的豆科模式植物截形苜蓿（Medicago truncatula，2n＝16）染色體組相同［16］，是理想的研究植物耐鹽機(jī)制的材料。目前，利用微列陣研究疏葉駱駝刺耐鹽相關(guān)基因表達(dá)譜的研究尚未見報(bào)道。試驗(yàn)利用Affymetrix公司的MedicagoGenome Array，檢測(cè)疏葉駱駝刺在鹽處理0h和24h根部的基因表達(dá)差異，尋找耐鹽相關(guān)基因，為進(jìn)一步克隆耐鹽基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)以疏葉駱駝刺為材料，材料由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)牧草育種與生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

將種子在4℃冰箱中放置2d進(jìn)行低溫春化，用98%的濃硫酸處理30min，用移液器將濃硫酸吸干，放在自來水下沖洗30min。在超凈工作臺(tái)上，用70%乙醇浸泡1min，然后用0.1%升汞溶液滅菌10min，無菌水清洗5次，放在鋪上2層濾紙培養(yǎng)皿上，黑暗條件下，進(jìn)行種子萌發(fā)。將萌發(fā)2d后長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，用220mmol/L的NaCl溶液進(jìn)行鹽處理，做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。分別取脅迫時(shí)間為0h和24h的根為試驗(yàn)材料，液氮速凍后，保存于－80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因芯片分析

利用Affymetrix公司的MedicagoGenome Array，檢測(cè)疏葉駱駝刺幼根在鹽處理0h和24h的基因表達(dá)譜。截型苜?；蚪M芯片包括61 278個(gè)探針?；蛐酒怯刹W生物有限公司生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室操作完成。

1.2.1 RNA提取和探針合成 植物總RNA用天根生化科技有限公司的植物總RNA提取試劑盒方法提取，反轉(zhuǎn)錄用Eukaryotic Poly－A RNA Control Kit試劑盒（Affymetrix）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，體外轉(zhuǎn)錄用 Message－AmpTMⅡ（Ambio）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，同時(shí)合成生物素標(biāo)記的cRNA。生物素標(biāo)記的cRNA于94℃保溫35min進(jìn)行片段化。取2μL片段化產(chǎn)物用甲醛變性電泳檢測(cè)片段化cRNA大小分布范圍，經(jīng)片段化的cRNA即為雜交用的探針。

1.2.2 芯片預(yù)雜及雜交 每張芯片注入250μL預(yù)雜交液，置于雜交爐中，45℃，60r/min旋轉(zhuǎn)預(yù)雜交10 min，吸出預(yù)雜交液，注入相應(yīng)體積澄清雜交液，將芯片平衡置于雜交爐中，45℃，60r/min旋轉(zhuǎn)雜交16h。

1.2.3 芯片清洗染色及掃描 雜交結(jié)束后，吸凈雜交液，注入與雜交液等體積的Wash Buffer A。利用Affymetrix公司的Fluidics Station 450進(jìn)行芯片清洗染色，90min，將芯片放入掃描儀中進(jìn)行掃描。

1.3 基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)的處理

利用Microarray sulteversion 5.0等軟件對(duì)芯片掃描所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因芯片檢測(cè)的質(zhì)量分析

以鹽處理0h和24h疏葉駱駝刺幼根為試驗(yàn)材料，與截型苜?；蛐酒M(jìn)行雜交，芯片中間的“＋”字、周圍的邊框以及GenechipMedicago等陽性對(duì)照信號(hào)正常；看家基因信號(hào)值及3′/5′比值正常；平均背景值與噪音值較低（表1）；0h和24h的Present Percent分別為8.4%和8.8%，數(shù)值正常。樣品各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)達(dá)到質(zhì)控要求，達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

表1 質(zhì)量檢測(cè)分析報(bào)告Table 1 QC Report

2.2 基因芯片檢測(cè)結(jié)果

利用Affymetrix公司提供的GCOS軟件對(duì)0h和24h芯片的雜交檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了掃描并分析。結(jié)果顯示，在61 278個(gè)探針中，0h檢測(cè)到的有5 133個(gè)，占總探針數(shù)的8.4%，24h檢測(cè)到的有5 378個(gè)，占總探針數(shù)的8.8%（表2）。

以0h樣品為CK，對(duì)擬鹽處理24h樣品的差異基因進(jìn)行檢測(cè)，分別得到與之比較上調(diào)ratio值≥1差異基因127個(gè)，下調(diào)ratio值≤－1的差異基因119個(gè)，上調(diào)ratio值≥2倍的差異基因有3個(gè)。以截型苜蓿在180mmol/L NaCl溶液擬鹽處理24h樣品為CK，對(duì)疏葉駱駝刺擬鹽處理24h樣品的差異基因進(jìn)行比較，共有相同的ratio值≥1和≤－1的差異表達(dá)基因50個(gè)。其中，在疏葉駱駝刺中表達(dá)上調(diào)的基因?yàn)?3個(gè)，下調(diào)的基因?yàn)?7個(gè)。

表2 疏葉駱駝刺0h和24hcRNA與截型苜蓿芯片雜交結(jié)果Table 2 Blotting results of Medicago Genome Array and cRNA of Alhagi sparsifolia under 0hand 24h

2.3 差異表達(dá)基因功能初步分析

按照Gene Ontology（GO）分類法則對(duì)ratio值≥1和≤－1的差異表達(dá)基因以及與截型苜蓿24h的交集差異表達(dá)基因在生化過程水平、分子功能水平兩方面進(jìn)行功能分析。（圖1）

2.3.1 差異表達(dá)（ratio值≥1和≤－1）基因的功能分析 由圖1可以看出，經(jīng)鹽脅迫后，在生化過程水平上，主要表達(dá)的差異基因參與新陳代謝和細(xì)胞壁形成。參與新陳代謝的上調(diào)基因43個(gè)，下調(diào)基因33個(gè)。參與細(xì)胞壁形成的上調(diào)基因44個(gè)，下調(diào)基因37個(gè)。在分子功能水平上，主要表達(dá)的差異基因具有催化活性和綁定活性。具有催化活性的上調(diào)基因45個(gè)，下調(diào)基因37個(gè)。具有綁定活性的上調(diào)基因34個(gè)，下調(diào)基因37個(gè)。參與細(xì)胞壁形成的上調(diào)基因50個(gè)，下調(diào)基因43個(gè)。參與細(xì)胞器形成是上調(diào)基因39個(gè)，下調(diào)基因31個(gè)。上下調(diào)一倍以上的基因還有63個(gè)未知功能的基因，有待進(jìn)一步的研究。

2.3.2 上調(diào)一倍以上與截型苜蓿24h的交集差異表達(dá)基因功能分析 由表3中的推測(cè)基因經(jīng)GO分析可知，經(jīng)鹽脅迫后，與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因有4個(gè)，與物質(zhì)能量運(yùn)輸相關(guān)的基因有9個(gè)，與新陳代謝相關(guān)的基因有5個(gè)，與逆境相關(guān)的基因有6個(gè)。

圖1 差異基因GO分析Fig.1 Differently expressed genes based on GO analysis

表3 上調(diào)交集差異表達(dá)基因功能分析Table 3 Function annotation of intersect up－regulated expressed genes

上調(diào)最高的基因是亞鐵血紅素基因（Mhb1，Msa.878.1.S1＿at），參與物質(zhì)運(yùn)輸，編碼非共生的血色素蛋白，在組織缺氧的情況下誘導(dǎo)表達(dá)，與CO信號(hào)傳導(dǎo)路徑相關(guān)［17］。富含脯氨酸蛋白基因（PRP2，Mtr.40069.1.S1＿x＿at）是PRPs家族成員，被假設(shè)為植物生長(zhǎng)調(diào)控、導(dǎo)管分化、抗逆的分子構(gòu)架［18］。甲酸脫氫酶基因（FDH，Mtr.37779.1.S1＿at）屬于 D－2－羥基酸脫氫酶類，可以將甲酸氧化為CO2，同時(shí)將NAD＋還原為NADH，維持新陳代謝穩(wěn)定進(jìn)行［19，20］。

分子在質(zhì)膜和液泡膜中的調(diào)節(jié)運(yùn)輸是植物響應(yīng)非生物脅迫的主要特征［21］。由表4可知，具有運(yùn)輸功能的基因有7個(gè)，占下調(diào)基因的63.64%，主要是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和質(zhì)膜蛋白。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在質(zhì)膜和液泡膜上都存在，一般能夠轉(zhuǎn)運(yùn)離子、有機(jī)大分子和小分子，保證植物體內(nèi)的離子平衡，滲透平衡，物質(zhì)交換與轉(zhuǎn)運(yùn)。運(yùn)輸功能的基因大量下調(diào)，說明疏葉駱駝刺幼根響應(yīng)鹽脅迫后，積累了大量滲透物質(zhì)和能量。

表4 下調(diào)交集差異表達(dá)基因功能分析Table 4 Function annotation of intersect down－regulated expressed genes

3 討論

基因表達(dá)芯片的檢測(cè)能力很大程度上取決于芯片上的探針數(shù)量、代表性和特異性［22］，本研究采用Affymetrix公司的苜?；蚪M芯片，包括48 116個(gè)截型苜蓿、1 850個(gè)紫花苜蓿和8 226個(gè)苜蓿根瘤菌已知表達(dá)序列。Affymetrix公司芯片獨(dú)特的PM－MM探針對(duì)復(fù)雜樣品背景的檢測(cè)具有高靈敏度和特異性，所獲得的數(shù)據(jù)翔實(shí)可靠［23］。同時(shí)，在芯片雜交過程中質(zhì)控嚴(yán)格，數(shù)據(jù)將更加可靠。鹽脅迫后，檢測(cè)到基因5 378個(gè)，占總探針數(shù)的8.8%，這可能因?yàn)樘结樞蛄信c目標(biāo)序列同源性低有關(guān)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，通過調(diào)整探針信號(hào)閾值范圍可以解決這一問題［23］，但疏葉駱駝刺與截型苜蓿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，疏葉駱駝刺中或許存在特有基因，苜?；蛐酒瑢o法檢測(cè)到這些基因，建立疏葉駱駝刺基因組芯片將會(huì)解決這一問題。

通過GO分析了上下調(diào)差異表達(dá)基因，對(duì)其功能進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因有4個(gè)，與物質(zhì)能量運(yùn)輸相關(guān)的基因有16個(gè)，與新陳代謝相關(guān)的基因有5個(gè)，與逆境相關(guān)的基因有6個(gè)。其中非共生的血色素蛋白，在組織缺氧的情況下誘導(dǎo)表達(dá)，與CO信號(hào)傳導(dǎo)路徑相關(guān)；脯氨酸蛋白基因被假設(shè)為植物生長(zhǎng)調(diào)控、導(dǎo)管分化、抗逆的分子構(gòu)架；甲酸脫氫酶基因可以將甲酸氧化為CO2，同時(shí)將NAD＋還原為NADH，維持新陳代謝穩(wěn)定。此外，我們可以將這些基因在鹽脅迫應(yīng)答和耐鹽反應(yīng)中的作用利用分子生物學(xué)手段使其過量表達(dá)或降低表達(dá)加以驗(yàn)證，從中篩選出具有實(shí)際意義上的耐鹽基因，為新型的耐鹽轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎(chǔ)。

［1］楊少輝，季靜.鹽脅迫對(duì)植物影響的研究進(jìn)展［J］.分子植物育種，2006（3）：139－142.

［2］Asish K P，Anath B D.Salt tolerance and salinity effects on plants a review［J］.Ecotoxicology and Environment safety，2004，60：324－349.

［3］馬雅琴，翁躍進(jìn)，趙勇，等.植物耐鹽相關(guān)基因克隆的研究進(jìn)展［J］.植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2004，5（1）：81－86.

［4］趙寶存，趙芊，葛榮朝，等.利用基因芯片研究小麥耐鹽突變體鹽脅迫條件下基因的表達(dá)圖譜［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，40（10）：2355－2360.

［5］Hong S W，Jon J H，Kwak J M，et al.Identification of a receptor－like protein kinase gene rapidly induced by abscisic acid，dehydration，high salt，and cold treatments in Arabidopsis thaliana［J］.Plant Physiol，1997，113：1203－1212.

［6］Analysis of regulatory pathways involved in the reacquisition of root growth after salt stress in Medicago truncatula［J］.Plant J，2007，51：1－17.

［7］Gruber V.Identification of transcription factors involved in root apex responses to salt stress inMedicago truncatula［J］.Mol Genet Genomics，2009，281：55－66.

［8］He P M，Zhang D B，Liang W Q，et al.Expression of choline oxidase gene（codA）enhances salt tolerance of tobacco［J］.Acta Biochim Biophy sin，2001，33（5）：519－524.

［9］Brini F.Cloning and characterization of a wheat vacuolar cation/proton antiporter and pyrophosphatase proton pump［J］.Plant physiology and biotechnology，2005，43：347－354.

［10］Kawasaki S.Gene expression profiles during the initial phase of salt stress in rice［J］.The Plant Cell，2001，13：889－905.

［11］李同祥.基因芯片與植物基因差異表達(dá)分析［J］.植物研究，2002，3：310－313.

［12］Seki M，Narusaka：Monitoring the expression profiles of 7000Arabidopsis genes under drought，cold and high－salinity stresses using a full－length cDNA microarray［J］.Plant Journal，2002，31（3）：279－292.

［13］時(shí)永杰.疏葉駱駝刺［J］.中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2003（增刊）：144－145.

［14］曾凡江，張希明，李小明.駱駝刺植被及其資源保護(hù)與開發(fā)的意義［J］.干旱區(qū)地理，2002，25（3）：286－288.

［15］董志國(guó).干旱荒漠區(qū)駱駝刺的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及其利用［J］.塔里木農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，12（3）：58－60.

［16］司馬義·巴拉提.兩種國(guó)產(chǎn)駱駝刺的染色體核型分析［J］.中國(guó)草地學(xué)報(bào)，1992，6：56－59，55.

［17］Seregēlyes C，Mrstárdy L，Ayaydin F.Nuclear localization of ahypoxia－inducible novel non－symbiotic hemoglobin in cultured alfalfa cells［M］.FEBS Letters，2000：125－130.

［18］Robert C，Wilson.Characterization of PRPl and PRP2 fromMedicago truncatula［J］.Plant Physiol，1994：105：445－446.

［19］黃志華.甲酸脫氫酶用于輔酶NADH再生的研究進(jìn)展［J］.過程工程學(xué)報(bào)，2006，6（6）：1011－1016.

［20］Zhang Y P.Introduction of an NADH regeneration system intoKlebsiella oxytocaleads to an enhanced oxidative and reductive metabolism of glycerol［J］.Metabolic Engineering，2009，11：101－106.

［21］Sahi C，Singh A，Blumwald E，et al.Beyond osmolytes and transporters：novel plant salt－stress tolerance－related genes from transcriptional profiling data［J］.Physiologia Plantarum，2006，127（1）：1－9.

［22］Wang J.Clustering of the SOM easily reveals distinct gene expression palIeres：Results ofa reanalysis of lymphoma study［J］.BMC Bioinformatics，2002，3：36－44.

［23］Cheng L.Model－based analysis of oligonucleotide arrays：Expression index computation and outlier detection［J］.PNAS，2001，98（1）：31－36.