胡 明，牛小媛

山西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山西太原 030001

腦出血是神經(jīng)科常見病，在常規(guī)治療后，大約有1/3的腦出血患者在發(fā)病后一段時(shí)間內(nèi)仍出現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)功能惡化，提示除血腫引起的急性神經(jīng)組織損害外，還存在有血腫周邊的繼發(fā)性損害。這部分患者在影像學(xué)上表現(xiàn)為持續(xù)存在的環(huán)形低密度影，對(duì)于此區(qū)域的認(rèn)識(shí)集中在水腫帶和缺血梗死帶兩方面。腦水腫主要與細(xì)胞內(nèi)外異常液體積聚有關(guān)，主要分成血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫，由于病變的程度以及病情發(fā)展的不同，這兩類腦水腫常常同時(shí)存在[1-2]；Forbes等[3]對(duì)出血灶區(qū)域的DWI及MRIT2加權(quán)像研究發(fā)現(xiàn)：血腫周圍除水腫外還是存在缺血帶。可見對(duì)于此區(qū)域水腫與缺血共存可以達(dá)到共識(shí)，但水腫、缺血隨時(shí)間的變化關(guān)系，至今還未有很明確的答案。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同時(shí)間點(diǎn)大鼠ICH模型血腫灶周的水腫與缺血的變化過程，探討大鼠腦出血水腫高峰期后灶周水腫及缺血的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，體重200 g左右，由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 試劑 2%TTC溶液、TUNEL試劑盒均購于山西省太原市boster試劑公司。

1.1.3 儀器 立體定位儀、必要手術(shù)器械；方正V70＋掃描儀、計(jì)算機(jī)設(shè)備及軟件。

1.2 動(dòng)物模型制作

大鼠術(shù)前8 h禁食，不禁水。參照 Deinsberger[4]、周中和等[5]的報(bào)道方法，采用二次注血/退針法：緩慢注射自體血100μl至基底節(jié)區(qū)制成大鼠ICH模型；對(duì)照組相同部位打孔進(jìn)針，不注血。實(shí)驗(yàn)陽性大鼠選擇參照Bederson等[6]的方法：神經(jīng)功能缺陷評(píng)分≥2分，及大鼠腦切片中有明顯的圓形、橢圓形或不規(guī)則的血腫存在為模型成功標(biāo)準(zhǔn)，血液針道反流、進(jìn)入腦室或死亡者均剔除。

1.3 試驗(yàn)分組

SD大鼠45只，30只造模。按起病后不同時(shí)間各分為3、5、7、14、21 d 5 個(gè)組，每組各 9 只（3 只對(duì)照＋6 只模型）。

1.4 腦組織HE染色及TTC染色

各組大鼠于ICH損傷后在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)用過量的水合氯醛麻醉，直接斷頭取腦，完整取出腦組織，用濾紙吸干腦組織表面的液體和血跡，-20℃冰箱冷凍20～30 min，以進(jìn)針點(diǎn)所在且垂直于大腦縱裂的冠狀面為中心（盡量通過血腫中心）切分腦組織為前后兩部分，向前向后取腦冠狀腦片各2片，在4片腦片中取包含血腫較小者固定，石蠟包埋，用于HE染色和TUNEL試驗(yàn)；將剩余3片腦片置已預(yù)熱到37℃的2%TTC溶液中，37℃恒溫箱內(nèi)避光染色20 min，再浸泡在4%多聚甲醛中固定8～12 h。掃描儀掃描標(biāo)本切面（光學(xué)分辨率和色彩位數(shù)分別設(shè)置為600 dpi，24位真彩色）。觀察灶周染色情況；運(yùn)行圖像處理軟件運(yùn)用Visual Basic 6.0，打開掃描圖像，測(cè)量梗死帶內(nèi)徑，單位為mm；測(cè)量血腫面積，單位為mm2。對(duì)照組同時(shí)同部位做相同處理。

1.5 水腫程度評(píng)估

取1.4中所述模型的剩余腦組織用電子天平先稱取濕重，電熱恒溫培養(yǎng)干燥兩用箱100℃烘烤48 h，再稱取干重。利用腦組織含水量=（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/鮮質(zhì)量×100%進(jìn)行計(jì)算。

1.6 TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞

①標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟（不過H2O2），用蒸餾水洗2次，PBS溶液洗2次，每次5 min。②配制新鮮的蛋白酶K（蛋白酶K 20μg溶于10 mM Tris/Hcl中），標(biāo)本片加新鮮稀釋蛋白酶K后37℃烤箱中孵育20 min。③20 min后，取出標(biāo)本，用PBS洗3次，每次5 min。④閉光環(huán)境下加TUNEL反應(yīng)混合物，加完后在37℃烤箱中孵育1 h，1 h后PBS洗3次，每次5 min。⑤避光環(huán)境下加POD 37℃溫箱中孵育30 min，后PBS洗3次，每次5 min。⑥D(zhuǎn)AB顯色：取1 ml蒸餾水，依次加入顯色試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后加至標(biāo)本片上，鏡下控制顯色時(shí)間3～10 min，水洗。⑦蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。運(yùn)用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，相同時(shí)間點(diǎn)手術(shù)組與對(duì)照組的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)；手術(shù)組不同時(shí)間點(diǎn)的組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE染色

光鏡下可見出血灶與遠(yuǎn)隔正常腦組織間有一過渡帶即血腫周圍區(qū)。3 d時(shí)，紅細(xì)胞溶解，出血灶周炎細(xì)胞增多以分葉核中性粒為主，水腫明顯，出現(xiàn)少量紅色的壞死神經(jīng)元；5 d時(shí)出現(xiàn)少量紅細(xì)胞溶解后的棕黃色顆粒，炎癥細(xì)胞，細(xì)胞水腫程度與3 d時(shí)相似，能看見少量壞死神經(jīng)元；7 d時(shí)依然可見水腫、炎細(xì)胞，且水腫細(xì)胞間夾雜有核固縮或碎裂的細(xì)胞，壞死神經(jīng)元細(xì)胞增加；14 d時(shí)水腫細(xì)胞明顯減少，大量壞死細(xì)胞及細(xì)胞框架，炎細(xì)胞及神經(jīng)元結(jié)構(gòu)不好辨認(rèn)；21 d時(shí)血腫吸收者留有中風(fēng)囊，囊周細(xì)胞基本正常。血腫未吸收者周邊喪失細(xì)胞結(jié)構(gòu)，色淡染，只見不全細(xì)胞結(jié)構(gòu)和壞死后的輪廓。

2.2 TTC染色

正常腦片被均勻染成玫紅色，灶周區(qū)域色淡染，梗死組織呈基本規(guī)則的白色帶條狀，血腫呈灰黑色。梗死帶結(jié)果見表1，血腫大小變化結(jié)果見表2。

表1 血腫周圍梗死帶最小內(nèi)徑（mm）（x±s，n=9）Tab.1 Minimum inside diameteraround infarctionspace(mm)(x±s,n=9)

表 2 血腫面積（mm2）（x±s，n=9）Tab.2 Haematoma area(mm2)(x±s,n=9)

2.3 水腫程度評(píng)估

腦組織含水量=（鮮質(zhì)量-干質(zhì)量）/鮮質(zhì)量×100%。見表3。

2.4 凋亡細(xì)胞檢測(cè)

陽性細(xì)胞為細(xì)胞核呈棕黃色，較小的棕黃色圓形小體為凋亡小體。在10×40倍光學(xué)顯微鏡下，圍繞梗死灶、出血灶中心取6個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野凋亡細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)，取均值。見表4。

3 討論

近年來的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腦出血神經(jīng)損傷機(jī)制除血腫引起的急性神經(jīng)組織損害外，還存在血腫周邊的繼發(fā)性損害。有研究顯示，急性腦出血灶周存在血流量下降（CBF），且急性期血腫周邊灌注缺損量與血腫體積呈正相關(guān)，但腦出血后4～6 h血液開始凝固縮小，血腫的機(jī)械壓迫作用造成的CBF下降在程度和時(shí)間上能否達(dá)到引起腦缺血性損傷的水平目前仍有爭(zhēng)議[7-8]。目前文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)試驗(yàn)大多集中于腦出血急性期灶周改變，3 d后的血腫灶周改變報(bào)道較少。Daverat等[9]的一個(gè)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，年齡是人類腦出血后功能恢復(fù)的重要因素之一；另有研究發(fā)現(xiàn)年老的大鼠制作為腦出血模型后，可誘導(dǎo)出相對(duì)于年輕大鼠更高的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活性[10]，提示遲發(fā)型腦水腫的出現(xiàn)幾率可能與年齡成反比（年齡越大，出現(xiàn)幾率越?。?。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮诔赡甏笫螅?00 g左右）腦內(nèi)注入自體血100μl，相當(dāng)于年輕人基底節(jié)區(qū)腦出血80 ml左右，這一血量可使血腫在3周內(nèi)不會(huì)完全被吸收，且把年齡影響因素降到最小。本試驗(yàn)結(jié)果顯示：水腫在3～7 d一直處于水腫高峰，14 d才明顯下降，與之前的研究結(jié)果3～5 d水腫達(dá)高峰時(shí)間延長(zhǎng)，可能因?yàn)槌鲅看?，吸收減慢，延長(zhǎng)了各種水腫因素的作用時(shí)間。同時(shí)還顯示，腦出血血腫與出血灶遠(yuǎn)隔區(qū)域存在一個(gè)區(qū)域。隨著出血時(shí)間延長(zhǎng)，此區(qū)域細(xì)胞形態(tài)改變、炎癥、組織水腫，組織缺血經(jīng)歷了一個(gè)從輕到重的動(dòng)態(tài)改變過程，任其發(fā)展，該區(qū)則發(fā)生不可逆損傷：出現(xiàn)與缺血梗死相似的病理變化。

表3 各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織含水量的變化（%，n=9）Tab.3 The changing of rats brain water content in different time spot(%,n=9)

表4 各時(shí)間點(diǎn)凋亡細(xì)胞陽性表達(dá)（x±s，n=9）Tab.4 The counting of apoptosis in different time spot(x±s，n=9)

腦出血引起細(xì)胞凋亡的詳細(xì)機(jī)制還不明確。出血周圍繼發(fā)性缺血、凝血酶釋放、血紅蛋白分解、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、各種細(xì)胞因子的表達(dá)等因素可能都是誘導(dǎo)腦出血血腫灶周細(xì)胞凋亡的因素。有研究顯示腦出血導(dǎo)致血腫周圍及遠(yuǎn)隔區(qū)域腦組織血流量下降，一般可降至正常的50%左右[11]，相對(duì)溫和的缺血不足以引起腦梗死，但易導(dǎo)致凋亡性細(xì)胞死亡[12]。本實(shí)驗(yàn)中各手術(shù)組間凋亡細(xì)胞數(shù)均有顯著差異，HE染色提示隨時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)不可逆的神經(jīng)細(xì)胞壞死，可能是由于血流量進(jìn)一步下降，加上凝血酶、血紅蛋白釋放及各種炎癥因子表達(dá)增加等因素，導(dǎo)致出血灶周凋亡細(xì)胞表達(dá)持續(xù)增加，最終發(fā)展為細(xì)胞壞死，血管閉塞，組織血液供應(yīng)終止，缺血性損傷發(fā)生。通過該實(shí)驗(yàn)我們認(rèn)為腦出血后出血灶周為一水腫缺血混合區(qū)域，從出血開始到出血后2周以水腫為主，2周后水腫相對(duì)穩(wěn)定，出現(xiàn)缺血改變，類梗死過程；細(xì)胞死亡形式開始以凋亡為主，后發(fā)展為細(xì)胞壞死，所以試驗(yàn)中14 d后，相似位置觀察到的凋亡細(xì)胞明顯下降，出現(xiàn)大量壞死細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)于腦出血水腫高峰期后的病程變化有一個(gè)較為直觀的闡述，為腦出血的治療，特別是在脫水治療時(shí)間方面提供新的思路。此外，通過試驗(yàn)我們可以看到細(xì)胞凋亡在腦出血后是極為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。因此，加大細(xì)胞凋亡在出血性腦損傷中的作用及腦出血導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的原理，利用各種方法阻止細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和發(fā)展，有可能成為防治出血性卒中的新途徑。

[1]Heo JH,Han SW,Lee SK.Free radicals as triggers of brainedema formation after stroke[J].Free Radie Biol Med,2005,39(1):51-70.

[2]Kimelberg HK.Current eoncepts of brainedema:review of laboratory investigations[J].JNeurosurg,1995,83(6):1051-1059.

[3]Forbes KP,Pipe JG,Heiserman JE.Diffusion-weighted imaging provides support for secondary neuronal damage from intraparenchymal hematoma[J].Neuroradiology,2003,45:363-367.

[4]Deinsberger W,Vogel J,Kuschinsky W,et al.Experimental intracerebral hemorrhage:description of a double injection model in rats[J].Neurol Res,1996,18(5):475-4777.

[5]周中和,曲方.一種改良大鼠自體血腦出血模型：二次注血/退針法[J].中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué),2004,12(4):406-408.

[6]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion:evaluation of the model and development of a neurologic examination[J].Stroke,1986,17(3):472-6.

[7]Xue M,Del-Bigio MR.Intracortical hemorrhage injury in rats:relationship between blood fractions and brain cell death[J].Stroke,2000,31(7):1721-1727.

[8]Peeling J,Yan HJ,Corbett D,et al.Effect of FK-506 on inflammation and behavioral outcome following intracerebral hemorrhage in rat[J].Exp Neurol,2001,167(2):341-347.

[9]Daverat P,Castel JP,Dartigues JF,et al.Death and functional outcome after spontaneous intracerebral hemorrhage:a prospective study of 166 cases using multivariate analysis[J].Stroke,1991,22(1):1-6.

[10]Gong Y,Hua Y,Keep RF,et al.hemorrhage:elects of agingon brain edema and neurological deficits[J].Stroke,2004,35(11):2571-2575.

[11]Yonezawa T,Hashimoto H,Sakaki T.Serial change of cerebral blood flow aftercollagenase induced intracerebral hemorrhage in rats[J].No Shinkei Geka,1999,27(5):419-425.

[12]Bennett SA,Tenniswood M,Chen JH,et al.Chronic cerebral hypoperfusion elicits neuronal apoptosisand behavioral imparement[J].Neuroreport,1998,9(1):161-166.