李玲，劉殿高，張譯文，趙春杰

(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院，110016)

烏頭湯是東漢著名醫(yī)家張仲景創(chuàng)制的名方，該方由制黃芪、麻黃、芍藥、甘草(炙)、川烏組成，具有溫經(jīng)散寒、祛濕鎮(zhèn)痛的功效，主治寒濕痹癥［1］。方中以川烏溫經(jīng)祛濕、散寒鎮(zhèn)痛，芍藥緩急舒經(jīng)鎮(zhèn)痛，以利筋骨屈伸［2］。制川烏與麻黃相配，祛痹鎮(zhèn)痛之力較著［3］。烏頭雖是有毒之品，在臨床上卻廣泛應(yīng)用于風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛、寒疝作痛、麻醉鎮(zhèn)痛等［2］。烏頭中的有毒成分也是其有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，甘草、白芍等對(duì)烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿影響較大［4］。而藥物與劑量是影響方劑療效的兩大因素，藥物組成相同的方劑，在劑量或配比不同時(shí)療效迥異，日本學(xué)者渡邊熙說(shuō):“漢藥之秘，不可告人者，即在藥量［5］?！币虼?，筆者在本實(shí)驗(yàn)中考察烏頭湯中制川烏與其余各味藥不同配比時(shí)對(duì)新烏頭堿和次烏頭堿含量的影響，以期調(diào)整和改善烏頭湯的組成配比，在其毒性不超限量的前提下，使新烏頭堿和次烏頭堿的含量達(dá)到較大值，以加強(qiáng)治療效果。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國(guó) Agilent公司)，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))，BS110型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，TG332A型微量分析天平(上海分析天平廠(chǎng))，AUTOSCIENCE AS3120超聲儀(功率 120 W，頻率40 kHz)。次烏頭堿、新烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品(均購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為0798-9403和0799-9403)。制川烏、麻黃、白芍、黃芪、炙甘草均購(gòu)自沈陽(yáng)四方藥大藥房，并經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院賈景明副教授鑒定，分別為Aconiti Radix Cocta，Ephedrae Herba，Paeoniae Radix Alba，Astragali Radix，Glycyrrhizae Radix Et Rhizoma Praeparata Cum Melle。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱溫:30 ℃，流動(dòng)相 A:乙腈-四氫呋喃(25∶15)，流動(dòng)相 B:0.1 mol·L-1醋酸銨(每1 000 mL加冰醋酸 0.5 mL)，A-B(20∶80);流速:1.0 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng):235 nm。

2.2 供試品溶液的制備 烏頭湯中制川烏6 g為定值，其他各味藥材(麻黃、白芍、黃芪、甘草)按照表1安排正交實(shí)驗(yàn)，采用L25(56)正交實(shí)驗(yàn)表，以新烏頭堿和次烏頭堿的含量之和作為考察指標(biāo)。取組方中各藥材，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加氨試液5 mL，精密加入乙酸乙酯-異丙醇(1∶1)溶液100 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取(功率120 W，頻率40 kHz，水溫＜25℃)30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用上述溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液50 mL，減壓回收溶劑至干(＜40℃)，殘?jiān)卯惐?三氯甲烷(1∶1)溶解并定容至5 mL量瓶中，用微孔濾膜(孔徑0.45 μm)濾過(guò)，即得。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Tab．1 The factors and levels g

2.3 對(duì)照品溶液的制備 取新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，分別加異丙醇-三氯甲烷(1∶1)溶解并制成0.396和0.974 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.4 色譜系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液、對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣5 μL分析，結(jié)果如圖1所示，各色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5。拖尾因子均在0.95～1.05之間。新烏頭堿、次烏頭堿的儀器精密度RSD分別為1.1%和1.9%。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 分別精密量取新烏頭堿、次烏頭堿對(duì)照品溶液適量，置5 mL量瓶中，用異丙醇-三氯甲烷(1∶1)稀釋至刻度，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣5 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果新烏頭堿、次烏頭堿回歸方程分別為Y=4.253X+30.98(r=0.999 4)，Y=3.713X+96.02(r=0.999 3)，線(xiàn)性范圍分別為4.95 ～79.20，12.18 ～194.80 μg·L-1。

2.6 烏頭湯中各組分對(duì)新烏頭堿和次烏頭堿的影響 按表2下的各組分正交實(shí)驗(yàn)組方制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣5 μL，將測(cè)得的新烏頭堿、次烏頭堿峰面積分別代入“2.5”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，計(jì)算各配比組方中新烏頭堿、次烏頭堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 2種溶液的典型色譜圖A.樣品溶液;B.混合對(duì)照品溶液 (新烏頭堿396 μg·mL-1，次烏頭堿 974 μg·mL-1);1.新烏頭堿;2.次烏頭堿Fig．1 Representative chromatogram of the two kinds of solutionsA.sample;B.mixed reference substance(mesaconiatine 396 μg·mL-1，hypaconitine 974 μg· mL-1);1.mesaconiatine 2.hypaconitine

由表2可見(jiàn)，各因素對(duì)新烏頭堿和次烏頭堿含量之和的影響為D＞C＞A＞B，最佳水平組合為A5B1C2D5，即黃芪、炙甘草各13 g，麻黃5 g，白芍7 g。

綜合分析，烏頭湯中制川烏與其余各味藥的不同配比對(duì)新烏頭堿和次烏頭堿含量影響很大，其中炙甘草的量影響最大，白芍次之。當(dāng)制川烏、麻黃、黃芪、白芍和炙甘草組方為 6，5，13，7，13 g時(shí)，新烏頭堿和次烏頭堿含量之和最大。

2.7 制川烏的雙酯型生物堿檢查 根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版的規(guī)定，制川烏含雙酯型生物堿以烏頭堿、次烏頭堿及新烏頭堿的總量計(jì)，不得超過(guò)0.040%。本實(shí)驗(yàn)中因制川烏所含烏頭堿的量很少或幾乎沒(méi)有而未被檢測(cè)到，所以制川烏中雙酯型生物堿的量以新烏頭堿和次烏頭堿的總量計(jì)，其含量值最大為0.003 5%，遠(yuǎn)小于規(guī)定值，因此符合規(guī)定。

3 討論

筆者在本實(shí)驗(yàn)中以制川烏的量為定值，在原方的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)烏頭湯中其余各味藥進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)得到不同的組成，與制川烏進(jìn)行配比，考察各味藥的用量對(duì)制川烏中有效成分的影響，以期改善原方的用量配比，達(dá)到最佳的治療效果。本實(shí)驗(yàn)以流動(dòng)相A∶ 乙腈-四氫呋喃(25∶15)，流動(dòng)相 B:0.1 mol·L-1醋酸銨(每1 000 mL加冰醋酸0.5 mL)為流動(dòng)相，A-B(20∶80)梯度洗脫，比《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版梯度洗脫的方法有所改進(jìn)，能夠簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)程序，且基線(xiàn)穩(wěn)定，漂移程度小［6］。

表2 新烏頭堿，次烏頭堿含量之和正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab．2 The results of orthogonal test on the content sum of mesaconiatine and hypaconitine

本實(shí)驗(yàn)旨在考察烏頭湯的組方配比對(duì)制川烏中雙酯型生物堿的影響，因此采用《中華人民共和國(guó)藥典》2010年版方法以乙酸乙酯-異丙醇(1∶1)溶液超聲提取，而不是采用傳統(tǒng)的水煎煮提取，目的是提高提取效率和新烏頭堿及次烏頭堿的含量，有利于測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)僅從烏頭湯所含的新烏頭堿和次烏頭堿的量的總和在不超過(guò)限量的前提下達(dá)到較大值方面進(jìn)行考察，下一步將會(huì)進(jìn)行藥效實(shí)驗(yàn)，將新組方與原方對(duì)比，考察新組方的實(shí)際療效。

［1］ 劉偉棟，施旭光，曠永強(qiáng)，等.烏頭湯對(duì)RA大鼠相關(guān)細(xì)胞因子影響的研究［J］.中藥材，2009，32(8):1267-1269.

［2］ 余成浩.烏頭類(lèi)有毒中藥常用配伍藥對(duì)的物質(zhì)基礎(chǔ)研究［D］.成都:成都中醫(yī)藥大學(xué)，2006.

［3］ 劉娜，劉文.HPLC法測(cè)定烏頭湯水煎液中鹽酸麻黃堿的含量［J］.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2008，20(7):33-35.

［4］ 劉忠英.中藥化學(xué)成分在炮制、配伍和提取過(guò)程中的化學(xué)變化及其轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的研究［D］.長(zhǎng)春:吉林大學(xué)，2005.

［5］ 施旭光，王沛堅(jiān).非線(xiàn)性回歸分析不同劑量配伍對(duì)烏頭湯中主要化學(xué)成分的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20(1):55-58.

［6］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:37.