馬秋林 郭義紅 劉彥慧

20世紀(jì)90年代中期，大量的流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，人乳頭狀瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）與宮頸癌的發(fā)生有密切的關(guān)系?，F(xiàn)已研究證實(shí)HPV是一種嗜人體皮膚和黏膜組織細(xì)胞的DNA病毒，可廣泛感染人類皮膚及生殖道、呼吸道上皮組織，目前已知有100多個(gè)基因型，大部分亞型對人體無害，少部分亞型對人體致病，根據(jù)其致病性危險(xiǎn)程度分為高危型和低危型，同時(shí)，高危型HPV和低危型HPV感染對人類的影響也存在明顯不同，前者與90%以上的宮頸癌有關(guān)，而后者則主要引起尖銳濕疣[1]。且有報(bào)道HPV病毒陽性孕婦可以垂直傳播給胎兒[2]。另外，不同年齡階段的人群對HPV敏感性也存在差異。而宮頸癌是少數(shù)幾個(gè)明確病因并且早期發(fā)現(xiàn)治愈率極高的腫瘤，所以進(jìn)行HPV分型檢測對預(yù)防與早期發(fā)現(xiàn)治療宮頸癌非常有必要，同時(shí)對于流行病學(xué)調(diào)查以及以后疫苗應(yīng)用都有非常重要的意義，本文即探討東莞地區(qū)HPV亞型分布情況以及各年段感染率情況。

1 對象和方法

1.1 對象

本醫(yī)院作為專科醫(yī)院，婦科門診量大，有著豐富的調(diào)查對象，包含各個(gè)年齡段，對本院2010年5月～2011年6月間1193例進(jìn)行HPV分型檢測的標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，年齡分布為15～57歲，分成≤20歲、21～30歲、31～40歲、41～50歲、≥51歲5個(gè)年齡段，由于時(shí)間跨度大，調(diào)查對象豐富，年齡分布合理，統(tǒng)計(jì)結(jié)果具有代表性。

1.2 儀器與試劑

采用ABI9700基因擴(kuò)增儀，奧盛K30b恒溫金屬浴，Eppendorf離心機(jī)等，試劑由廣州達(dá)安基因公司提供。

1.3 檢測方法

采RDB(反向點(diǎn)雜交)技術(shù)，具有簡便快速、靈敏度高的特點(diǎn)，本試劑盒能檢測19個(gè)亞型，包括16個(gè)高危型（16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，亞型CP8304型）和3個(gè)低危型（6，11，43型）。用專用的標(biāo)本采集拭子，由熟練的婦產(chǎn)科醫(yī)生采集。采集來的標(biāo)本在PCR室作下如下處理：將棉拭子上的細(xì)胞或組織洗脫于1mL生理鹽水中，擠干棉拭子，將洗脫液置于1.5mL離心管中，12000rpm離心10min，吸去上清液，重復(fù)以上步驟（洗去雜質(zhì)），在離心管的沉淀中加50μLDNA提取液充分混勻，放在金屬浴上100℃保溫10min，隨后離心5min，取5μL模板加入到試劑盒提供的反應(yīng)體系中，6000rpm瞬時(shí)離心3s，試劑附帶的陰陽質(zhì)控品同標(biāo)本處理，進(jìn)行質(zhì)量控制。最后放到擴(kuò)儀上，按以以下程序擴(kuò)增：93℃ 3min預(yù)變性，然后按93℃ 40s→55℃ 40s →72℃ 40s擴(kuò)增，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，隨后對擴(kuò)增產(chǎn)物嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行雜交、洗膜，顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用x2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

根據(jù)膜條上預(yù)先設(shè)置的探針點(diǎn)，當(dāng)檢測出某個(gè)亞型，即在相應(yīng)的探針位點(diǎn)顯示紫藍(lán)色的圓點(diǎn)。

2.1 HPV感染率及亞型分布情況

在1193例送檢樣本中，檢出HPV陽性病例296例，陽性率為24.8%，而HPV感染有地區(qū)差異，據(jù)報(bào)道，沈陽地區(qū)HPV陽性檢出率為21.63%，貴州地區(qū)為25.9%，這兩個(gè)地區(qū)檢出的主要亞型按順序?yàn)?6、52、58、11、51 5種，與報(bào)道的檢出亞型一致[3-4]，見表1，而且檢出了試劑合能檢測全部亞型。因我們是婦幼?？漆t(yī)院的關(guān)系，只做女性HPV檢測，對性男性感染率，本文并沒有作統(tǒng)計(jì)。在296例陽性標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)多重陽性標(biāo)本46陽性，占陽性標(biāo)本15.5%，且主要是二重感染，296例陽性標(biāo)本中檢驗(yàn)亞型366例，排在前5位的亞型如下分別為16、52、58、11、51，陽性例數(shù)分別為60、44、36、34、32例，分別占16.3%、12.0%、9.8%、9.2%、8.7%。

2.2 HPV感染與年齡的關(guān)系

檢出296例陽性標(biāo)本，統(tǒng)計(jì)各年齡段陽性檢出率，本文統(tǒng)計(jì)年齡的跨度為16～57歲，把年齡段分為5個(gè)檔次，各年齡段HPV感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各年齡組HPV陽性檢出情況

2.3 各年齡段亞型分布情況

對于各年齡段HPV亞型分布情況，分別統(tǒng)計(jì)各年齡段每個(gè)亞型的檢出例數(shù)，發(fā)現(xiàn)各年齡段HPV亞型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 各年齡段亞型的分布情況

3 討論

HPV是一種誘發(fā)女性宮頸癌及生殖器病變的主要病原體，HPV致病作用與HPV DNA的整合有關(guān)，病毒核酸整合到宿主細(xì)胞內(nèi)，使宿主細(xì)胞內(nèi)染色體發(fā)生突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，主要是HPV轉(zhuǎn)錄翻譯成的E6、E7蛋白，蛋白與細(xì)胞內(nèi)腫瘤抑癌基因P53與Rb基因結(jié)合，從而干擾細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)，使細(xì)胞永生化，而E6、E7蛋白主要由高危型HPV表達(dá)，所以十分有必要對HPV進(jìn)行分型[4-5]。對各年齡段的感染率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)≤20歲和≥51歲兩個(gè)年齡段感染率明顯高于其它年齡段，HPV感染有年輕化的趨勢，跟婚前性行為有關(guān)，須引起重視，在≥51歲偏高跟婦女年齡增高身體免疫力以及更年期后身體激素變化相關(guān)，更應(yīng)該在這兩個(gè)年齡段加強(qiáng)預(yù)防HPV感染和宮頸癌篩查知識的宣傳[6]。

本文也對各年齡段感染亞型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理發(fā)現(xiàn)≤20歲年齡段51型為主要亞型，41～50歲年齡段33型為主要亞型，其余幾個(gè)年齡段，差異不大，16型依然占主要亞型，這提示我們以后區(qū)別對待各年齡段的HPV防治。

HPV疫苗也在進(jìn)行二期臨床階段，而疫苗也主要針對E6、E7作為靶抗原，這種疫苗不是針對所有的亞型，所以有必要普查各地區(qū)亞型分布情況，優(yōu)先接種感染率高亞型，不同地區(qū)根據(jù)亞型分布情況，以及各年齡段亞型分布情況，區(qū)別對待，接種相應(yīng)亞型疫苗，對于預(yù)防HPV感染意義重大。2006年6月，美國食品與藥品管理局(FDA)正式批準(zhǔn)Gardasil宮頸癌預(yù)防性疫苗上市，是世界上第一個(gè)腫瘤疫苗，標(biāo)志著宮頸癌防治已進(jìn)入了一級預(yù)防。此疫苗為二價(jià)疫苗，主要針對HPV16、18型，而HPV型別分布存在明顯的地區(qū)差異，在我國尚缺乏系統(tǒng)的、全面的、科學(xué)的HPV型別地區(qū)分布情況數(shù)據(jù)，HPV型別檢測可為中國的HPV疫苗研究提供數(shù)據(jù)資料，HPV感染有地區(qū)性差異，我國及亞州其他國家52、58占據(jù)次要位置，所以針對這種情況，要著力研究在中國出現(xiàn)比較多的亞型、以及多重疫苗。就東莞地區(qū)來說，將來如果有多種疫苗上市選擇，應(yīng)優(yōu)先接種16、52、58型疫苗，如果是≤20歲和41～50歲年齡段可以分別優(yōu)先接種51、33亞型。

在296例檢出標(biāo)本中，發(fā)現(xiàn)46例多重感染病例，其中發(fā)現(xiàn)有16亞型的40例，占86.9%，二重感染38例，占86.2%，這些使臨床治療更為復(fù)雜。由于不同亞型HPV其編碼外殼蛋白的基因變異很大。不同亞型HPV之間基本上沒有交叉保護(hù)抗體，容易造成不同高危型 HPV多重感染或者交叉感染。而Lee等[7]進(jìn)一步研究了多重HPV感染與宮頸癌的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單一HPV感染使宮頸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)增加19.9倍，而多重HPV感染使該風(fēng)險(xiǎn)增加到31.8倍，對多種感染患者在物理治療和藥物治療方面采取相應(yīng)的措施，效果會(huì)更好。綜上所述，對HPV基因分型的檢測在宮頸癌的早期診斷和防治有重要意義。

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