王云龍,周春峰,孫新城,李玉林,陳冬煥,李恒思,昌靜峰,王國強(qiáng),董彩文,,劉旺根,

(1.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州 450001;2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450121;3.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450001;4.鄭州大學(xué) 河南鄭州 450001)

甲型H1N1流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法的初步建立

王云龍1,2*,周春峰1,孫新城4,李玉林3,陳冬煥3,李恒思3,昌靜峰3,王國強(qiáng)3,董彩文3,4,劉旺根3,4

(1.河南工業(yè)大學(xué),河南鄭州 450001;2.鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南鄭州 450121;3.河南省生物工程技術(shù)研究中心,河南鄭州 450001;4.鄭州大學(xué) 河南鄭州 450001)

建立甲型H1N1流感病毒雙抗體夾心ELISA檢測方法,通過優(yōu)化IPTG濃度和誘導(dǎo)時間確定HA融合蛋白的最佳表達(dá)條件,并進(jìn)行Western bloc和血凝試驗鑒定。用純化蛋白制備單克隆抗體,建立檢測甲型H1N1流感病毒的雙抗體夾心ELISA檢測方法,對其交叉反應(yīng)、符合率進(jìn)行驗證。結(jié)果表明,HA蛋白在BL21(DE3)中得到表達(dá),主要以包涵體的形式存在,分子質(zhì)量為64 ku,最佳誘導(dǎo)條件為IPTG終濃度0.2 mmol/L,誘導(dǎo)時間4 h。Western blot鑒定其與H1N1病毒有相同的抗原性,血凝試驗表明無血凝活性。制備HA單抗并初步建立雙抗體夾心ELISA檢測方法,檢測100份陽性PCR樣本,符合率為96%。建立的夾心ELISA方法可用于H1N1亞型流感病毒的初步診斷。

血凝素;甲型H1N1流感病毒;原核表達(dá);雙抗體夾心ELISA

*通訊作者

2009年新型三源重組甲型人流感病毒(H1N1)在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[1-2?,給世界造成了嚴(yán)懲經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。流感病毒屬于正黏病毒科,病毒基因組含8個負(fù)鏈單股RNA,其中血凝素(HA)糖蛋白由片段4編碼,是病毒最重要的表面抗原,具有亞型特異性,可以誘導(dǎo)特異性中和抗體的產(chǎn)生,對流感病毒及其亞型的診斷具有重要的價值。

甲型H1N1流感病毒的檢測方法包括病毒分離鑒定、PCR、基因芯片技術(shù)等[3-4]。病毒分離鑒定需較長時間和嚴(yán)格的無菌操作,PCR技術(shù)需要昂貴的設(shè)備和受過特殊專業(yè)培訓(xùn)的人員。本研究通過表達(dá)H1N1亞型流感病毒的HA基因,制備抗HA單克隆抗體,初步建立檢測H1N1亞型流感病毒的夾心ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 含有H1N1亞型HA蛋白基因原核表達(dá)質(zhì)粒(pET-30 Xa/LIC-HA),由河南省生物工程技術(shù)研究中心構(gòu)建并保存,E.coliBL21(DE3)由本實驗室保存。

1.1.2 病毒和血清 甲型流感病毒H1、H5、H9亞型及腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)、麻疹病毒(morbillivirus,MV)滅活物由河南省生物工程中心提供,標(biāo)準(zhǔn)陽性樣品(流感病毒裂解疫苗201004A001)購自華蘭生物制品有限公司;標(biāo)準(zhǔn)陰性樣品、鼠抗H1N1流感病毒陽性血清由本實驗室保存。

1.1.3 試劑 酶標(biāo)兔抗HA多抗由河南省生物工程技術(shù)研究中心制備;甲型H1N1流感病毒 RNA檢測試劑盒購自北京金豪制藥公司;蛋白Marker(SM0441)購自晶美公司;His Bind Purification Kit購自 Novagen公司;山羊抗鼠 IgG-HRP,RPMI-1640、HT、HAT、DAB、IPTG 購自 Sigma 公司;PEG2000購自Merck公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 實驗動物 Balb/c純系小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院動物研究所。

1.2 方法

1.2.1 最佳誘導(dǎo)條件的確定 挑單個BL21(DE3)菌落接種于3.5 mL LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中37℃振蕩培養(yǎng),OD600nm至0.6～0.8時分別加 IPTG 終濃度至 0.05、0.1 、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L,于 37℃下誘導(dǎo)表達(dá) 5 h,取不同時間段(誘導(dǎo)表達(dá) 0 、2、3 、4、5、6、7、8 h)的菌液各 1 mL煮沸裂解,離心后加水和上樣緩沖液進(jìn)行SDSPAGE電泳。

1.2.2 表達(dá)產(chǎn)物的純化 最佳條件下大樣誘導(dǎo)并對產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳,進(jìn)行可溶性分析。按照His Bind Purification Kit說明書純化,用鹽酸胍透析復(fù)性[5]。

1.2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 按照Sambrook方法進(jìn)行Western blot[6]。一抗用鼠抗H1N1流感病毒血清(1∶500),二抗用酶標(biāo)兔抗鼠 IgG抗體(1∶1 000)鑒定活性。并用純化蛋白進(jìn)行微量法紅細(xì)胞凝集試驗[7]。

1.2.4 單抗制備 將HA抗原與弗氏完全佐劑按1∶1混合,充分乳化,皮下多點免疫6周齡～8周齡雌性Balb/c小鼠,75 μg/只,2周后改用弗氏不完全佐劑,免疫 3～4次。取抗血清效價較高(1∶25 600)小鼠于融合前3 d尾靜脈免疫。無菌摘除小鼠脾臟,在200目不銹鋼網(wǎng)上研磨制得脾細(xì)胞懸液并計數(shù)。融合時將脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞按8∶1的數(shù)量比混合,在0.8 mL PEG2000的作用下進(jìn)行融合,在 60 s內(nèi)滴完,邊加邊攪拌,靜置 90 s。最后由慢到快向前述融合細(xì)胞中滴加30 mL RPMI-1640培養(yǎng)液終止融合反應(yīng),1 400 r/min離心7 min,收集細(xì)胞用適量HAT培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,100 μL/孔加入鋪有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。HAT、HT篩選后采用間接ELISA篩選陽性孔[8-9]。經(jīng)3次克隆化后,擴(kuò)大培養(yǎng)并收集細(xì)胞注射小鼠,制備腹水,采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體[10-11]。

1.2.5 檢測方法的建立

1.2.5.1 包被單抗及酶標(biāo)多抗最佳工作濃度的確定 將標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性樣品均作1∶100倍稀釋,采用方陣滴定法[12-13]確定最佳單抗包被濃度和酶標(biāo)多抗稀釋度。采用常規(guī)夾心ELISA方法,用包被液將純化單抗加入96孔板,100 μL/孔,4 ℃過夜;洗滌后加封閉液 150 μL/孔 37 ℃孵育 2 h;洗滌 3次加入100 μL/孔樣品,37℃孵育30 min;洗滌后加酶標(biāo)多抗100 μL/孔37 ℃孵育30 min;洗滌后加 TMB底物反應(yīng)體系 100 μL/孔,37 ℃孵育 20 min;加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng),雙波長(測定波長為450 nm,參考波長為630 nm)測OD值。

1.2.5.2 陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 取12份甲型H1N1流感病毒RNA檢測試劑盒測定的陰性咽拭子樣本,雙波長測定OD值,每份樣品設(shè)立兩個重孔。計算出 12份樣品的平均 OD值和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)。根據(jù)統(tǒng)計學(xué)原則,樣本的OD值＞陰性樣本OD均值(X)+3×SD時,判為陽性,OD值＜陰性樣本OD均值(X)+2×SD時為陰性,兩者之間為可疑,需重復(fù)檢測一次,OD值＞OD均值(X)+3×SD者判為陽性,其他均判為陰性[14-15]。

1.2.5.3 特異性試驗 用建立的雙抗體夾心ELISA方法對H5、H9亞型及EV71病毒、麻疹病毒滅物進(jìn)行特異性交叉反應(yīng),同時設(shè)H1亞型陽性、陰性對照。

1.2.5.4 符合率試驗 取100份甲型H1N1流感病毒RNA檢測試劑盒測定的陽性咽拭子樣本,用建立的雙抗體夾心法雙波長測定OD值,對比符合率。

2 結(jié)果

2.1 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

SDS-PAGE顯示IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L,最佳誘導(dǎo)時間為4 h,表達(dá)產(chǎn)物大小約為64 ku,與設(shè)計相符。此條件下目的蛋白表達(dá)量最大,主要以包涵體的形式存在(圖1)。用His Bind Purification Kit進(jìn)行表達(dá)產(chǎn)物純化(圖2),用鹽酸胍透析復(fù)性。純化后蛋白經(jīng)Western blot鑒定,目的條帶明顯清晰(圖3),同時將復(fù)性蛋白倍比稀釋做紅細(xì)胞凝集試驗,各稀釋度孔均未能凝集紅細(xì)胞,說明目的蛋白無血凝活性。

2.2 單克隆抗體鑒定結(jié)果

獲得1株雜交瘤細(xì)胞,注射小鼠制備腹水,測定效價達(dá)到1∶100 000。采用辛酸-硫酸銨沉淀法純化抗體。結(jié)果顯示純化抗體濃度達(dá)到95%以上(圖4)。

2.3 檢測方法的建立

2.3.1 包被單抗及酶標(biāo)多抗最佳工作濃度的確定

通過方陣滴定確定單抗最佳包被量為100 ng/孔,酶標(biāo)多抗最佳稀釋度為1∶400(表1),此條件下OD陽性值為0.983,陰性值為0.038,且P/N值較大。

2.3.2 陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的確定 對12份陰性樣本測定OD都在0.03～0.09之間,均一性較好,OD平均值為0.05,SD值為0.02。OD值＞陰性樣品OD的平均值+3×SD=0.11判為陽性,OD值＜陰性樣品OD的平均值+2×SD=0.09判為陰性,兩者之間為可疑樣品,對可疑樣品重復(fù)檢測一次,將OD值大于0.11者判為陽性,其他均判為陰性(表2)。

圖1 HA基因表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析Fig.1 Solubility analy sis of the expressed product

圖2 融合蛋白的純化Fig.2 The purification of the fusion protein

圖3 HA基因表達(dá)產(chǎn)物Western-blot分析Fig.3 Western-blot analysis of recombinant protein HA

圖4 腹水中單克隆抗體純化Fig.4 Purified McAb from ascites fluid

表1 最適單抗包被濃度和酶標(biāo)多抗工作濃度的確定Table 1 Determination for optimal concentration of coated McAb and peroxidase

表2 陰陽性結(jié)果的判定Table 2 Determination for positive and negative criterion

2.3.3 交叉反應(yīng)試驗 用建立的夾心ELISA方法檢測 H5、H9亞型及 EV71病毒、麻疹病毒,結(jié)果均呈陰性,陽性對照OD值為1.017,說明該方法對H1N1亞型流感病毒具有較高特異性(表3)。

表3 交叉反應(yīng)試驗Table 3 Results of cross-reaction

2.3.4 符合率試驗 用建立的夾心ELISA方法檢測100份陽性PCR樣品,符合率96%,說明該方法與PCR檢測結(jié)果有較高一致性。

3 討論

本研究采用大腸埃希菌BL21(DE3)對HA進(jìn)行表達(dá),融合蛋白主要以包涵體的形式存在,Western-blot反應(yīng)呈陽性,表明表達(dá)的融合蛋白具有與H1N1相同的線性表位。血凝試驗表明原核表達(dá)的HA蛋白不具有血凝活性,說明其與天然構(gòu)象存在差異。可能因其為原核系統(tǒng)表達(dá),蛋白缺少糖基化等修飾作用,其經(jīng)變性復(fù)性后,蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)可能有所改變,使其缺乏血凝等生物學(xué)活性。有文獻(xiàn)報道真核表達(dá)的HA蛋白具有血凝活性[15],但至今尚未見原核表達(dá)的HA蛋白具有血凝活性的報道。

獲得針對檢測原的特異性抗體是建立特異性檢測體系的關(guān)鍵,本試驗在制得酶標(biāo)多抗的基礎(chǔ)上,制備特異性的單抗,細(xì)胞融合是單抗制備的關(guān)鍵步驟,需要一定經(jīng)驗才能順利完成。試驗表明建立的夾心ELISA方法具有較好特異性和靈敏度,而且操作簡單,不需要特殊設(shè)備,即可實現(xiàn)對流感病毒型特異性的快速檢測,在臨床中非常具有實用價值。另外,通過體系優(yōu)化,參考國家標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線后,對流感病毒可實現(xiàn)定量檢測,同時該體系可對流感疫苗主要成分HA蛋白實現(xiàn)定量檢測,滿足流感疫苗效力的控制要求,這將對流感預(yù)防和控制起到重要作用。

綜上所述,該方法的建立為流感亞型標(biāo)準(zhǔn)化診斷試劑的開發(fā)奠定了基礎(chǔ),也可為流感檢測和控制提供參考,因此具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

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Development of Double-antibody Sandwich ELISA for Detecting Influenza Virus(H1N1)

WANG Yun-long1,2,ZHOU Chun-feng1,SUN Xin-cheng4,LI Yu-lin3,CHEN Dong-huan3,LI Heng-si3,CHANG Jing-feng3,W ANG Guo-qiang3,DONG Cai-wen3,4,LIU Wang-gen3,4

(1.Henan University of Technology,Zhengzhou,Henan,450001,China;
2.Zhengzhou Technical College,Zhengzhou,Henan,450121,China;
3.Henan Biotechnology Research Center,Zhengzhou,Henan,450001,China;4.Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan,450001,China)

To establish the Sandwich ELISA for H1N1 subtype Influenza Vilus.The best expression condition was determined by optimizing IPTG concentration and induction time.The protein was identified by Western blot and hemagglutination test.To prepare monoclonal antibody against purified recombinant protein of HA and establish the Sandwich ELISA for H1N1 subtype Influenza Vilus.Cross-reaction and coincidence rate of the method were tested.HA protein was successfully expressed with proper inducing conditions of 0.2 mmol/L IPTG and 4 hours induction inE.coliBL21(DE3).The fusion protein was mainly in the form of inclusion body,about 64 ku,Western-blot analysis proved that the recombinant protein had good reactive ability.Monoclonal antibody against recombinant protein was prepared and the Sandwich ELISA was established preliminarily,the results from detection of 100 samples by ELISA were 96%in agreement with that of RCR test.It suggested that the Sandwich ELISA could be useful for primary diagnoses of H1N1 subtype Influenza Vilus.

HA;H1N1 subtype influenza virus;prokaryotic expression;double-antibody sandwich ELISA

S5852.659.5

A

1007-5038(2011)08-0037-04

2010-12-15

鄭州市重大科技專項(093SGBS22027);2010河南省工程技術(shù)中心專項經(jīng)費(102102313105)

王云龍(1962-),男,河南洛陽人,教授,主要從事生物制藥研究。