張涵淞，扈鴻霞，趙靈燕，周彩琴，李肖梁，方維煥，徐 輝＊

（1.浙江大學(xué)浙江省動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029；2.浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310020）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）屬于套式病毒目動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的成員，是引起豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）的病原。臨床主要表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬與育肥豬的呼吸困難等。1991年確認(rèn)PRRSV有2個(gè)基因型，即歐洲型和北美洲型。

PRRSV的基因組為一條單鏈、不分節(jié)段的正鏈RNA，大小約為15kb。5′端有帽子結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，3′端有poly（A）尾結(jié)構(gòu)。PRRSV基因組含有9個(gè)開(kāi)放閱讀框，ORF1a和ORF1b編碼復(fù)制酶和聚合蛋白，ORF2a、ORF2b編碼結(jié)構(gòu)蛋白。ORF1a編碼蛋白pp1a，裂解后產(chǎn)生9個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白 Nsp1α，Nsp1β，Nsp2Nsp 8。研究發(fā)現(xiàn)，ORF1a的變異最為明顯，其中非保守氨基酸的變異主要集中在Nsp2［1］。

Nsp2約有980個(gè)氨基酸，是PRRSV中最大的蛋白，有3個(gè)結(jié)構(gòu)域，即N末端的半胱氨酸蛋白酶區(qū)（PL2）、C末端的疏水性跨膜區(qū)（TM）和一個(gè)中間功能不祥的區(qū)域［2－3］。一般情況下，PL2區(qū)域比較保守，而中間及TM區(qū)域有3個(gè)高變區(qū)［4］。2006年“高熱病”在中國(guó)暴發(fā)［5－7］，當(dāng)時(shí)有學(xué)者認(rèn)為是與Nsp2的30個(gè)氨基酸缺失有關(guān)［5］，所以近年來(lái)關(guān)于PRRSV的研究逐步轉(zhuǎn)向Nsp2。本試驗(yàn)對(duì)2008年－2009年從浙江省不同豬場(chǎng)采集分離的41株來(lái)自發(fā)生高熱病死亡豬只的PRRSV進(jìn)行了Nsp2基因序列的克隆和序列分析，旨在分析該地區(qū)Nsp2基因分子進(jìn)化特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集2008年－2009年間發(fā)生高熱病且死亡豬的肺臟、淋巴結(jié)和脾臟組織41份，死亡豬只均來(lái)源于杭州、紹興、湖州、嘉興、麗水、寧波、衢州、溫州和金華等地區(qū)的不同豬場(chǎng)。

1.1.2 試劑 總RNA提取試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品；RNA酶抑制劑、DTT均為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；dNTPs、Super Taq為上海申能博彩生物科技有限公司產(chǎn)品；連接試劑盒和pMD18－T載體為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；UNIQ－5柱離心式膠回收試劑盒為Axygen公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 在Nsp2保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)1對(duì)引物用于PRRSV病毒的檢測(cè)，Nsp2－1：5′－GCACCAGTTCCTGCACCGC－3′， Nsp2－2： 5′－AGGGAGCTGCTTGATGACACAG－3′，擴(kuò)增 Nsp2部分片段，Nsp2未缺失株的片段大小為317bp，缺失株的片段大小為227bp。引物均采用Primer Select 5.0軟件設(shè)計(jì)，由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司合成。

根據(jù)GenBank發(fā)表的PRRSV的全基因組序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增 Nsp2的特異性引物，A2－1：5′－GACACACATGGACCTATCGTCATAC －3′，A3－2：5′－CTGCACTCAGGATCAGCTTTCACTC －3′（第 1輪）；Nsp2－full－1：5′－GTTGAGCCCAATACGTCACCA －3，Nsp2－full－2：5′－CTCCAGCCAAGATACAGTCTGC－3′（第2輪），擴(kuò)增片段為2 992bp。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和RT－PCR檢測(cè) 取少量組織病料（包括脾、肺、淋巴結(jié)），剔除結(jié)締組織，加入0.02mol／L PBS 1mL，用銅紗網(wǎng)和研缽進(jìn)行研磨。將研磨好的組織懸液放入干凈的1.5mL離心管中，反復(fù)凍融3次，5 000r／min離心10min。分別取200μL病料上清抽提病毒RNA（按試劑盒說(shuō)明操作）。20μL體系合成cDNA：RNA樣品10μL、下游引物N2（25μmol／L）1μL，混勻。65℃水浴5 min，后放置冰上2min。5×MMLV buffer 4μL，dNTP Mix（10mmol／L）2μL，DTT 2μL，RNasin（30U／L）0.5L以及 MMLV reverse transcriptase（100U／L）0.5μL，輕輕混勻。42℃作用1h，95℃水浴5min后，取2μL cDNA為模板進(jìn)行套式PCR檢測(cè)。

第1輪反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液3μL，10 mmol／L dNTP Mix 0.6μL，25μmol／L A2－1 0.5 μL，25μmol／L A3－2 0.5μL，Super Taq 0.5μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至30μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃40s，58℃30s，68℃3min 35 s，30個(gè)循環(huán)；68℃ 延伸10min。取0.5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。第2輪反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液3μL，10mmol／L dNTP Mix 0.5μL，25 μmol／L Nsp2－full－1 0.5μL，25μmol／L Nsp2－full－2 0.5μL，Super Taq 0.5μL，滅菌ddH2O補(bǔ)足至30 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃40 s，60℃30s，68℃3min，30個(gè)循環(huán)；68℃ 延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的克隆、鑒定與測(cè)序 將上述PCR產(chǎn)物用UNIQ－5柱進(jìn)行割膠回收，純化的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后，由Invitrogen上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對(duì)核苷酸序列進(jìn)行雙向測(cè)定。

1.2.3 序列分析 用DNA Star軟件中的 Meg A－lign方法對(duì)PRRSV分離株的Nsp2基因序列與GenBank中發(fā)表的PRRSV Nsp2序列進(jìn)行比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)。對(duì)NSP2全長(zhǎng)氨基酸序列也進(jìn)行比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 Nsp2基因的克隆與序列測(cè)定

對(duì)41份病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，有21個(gè)毒株用RT－PCR的方法擴(kuò)增Nsp2基因條帶大小為317 bp，為Nsp2未缺失株；另20個(gè)毒株所擴(kuò)增的目的條帶大小為227bp，為Nsp2缺失株（圖1）。

2.2 Nsp2基因序列分析

將這41條Nsp2基因序列用DNA Star軟件中的MegAlign方法與GenBank中發(fā)表的PRRSV Nsp2序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)41條基因之間的核苷酸同源性比較高，為89.2%～100.0%。其中20個(gè)缺失株之間的核苷酸同源性為94.2%～99.8%；21個(gè)非缺失株之間的核苷酸同源性為99.2%～100.0%。20個(gè)缺失株與國(guó)內(nèi)分離的高致病性PRRSV毒株HUN4、JXA1等Nsp2基因序列的同源性為95.9%～99.4%，與北美洲型標(biāo)準(zhǔn)毒株VR2332和國(guó)內(nèi)分離的PRRSV經(jīng)典毒株CH2002等Nsp2基因序列的同源性?xún)H為52.8%～61.7%。21個(gè)非缺失株與VR2332、CH2002等經(jīng)典毒株Nsp2基因序列同源性為81.1%～93.5%，與HUN4、JXA1等Nsp2基因序列的同源性?xún)H為59.2%～60.1%。

圖1 病豬樣本的中PRRSV病毒的PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of PRRSV from clinical samples of pigs

從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)中可知PRRSV分離株可構(gòu)成兩個(gè)基因型，即歐洲型和北美洲型（圖2）。2008年－2009年我們分離到的PRRSV均屬于北美洲型，其中22－09－WZ64等20株屬于亞群1，18－09－NB67等21株屬于亞群2。此外，在亞群2上存在2個(gè)分支：一個(gè)為本試驗(yàn)分離毒株；另一個(gè)為GenBank中已登錄的早期的國(guó)內(nèi)外分離毒株。

圖2 以Nsp2基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建PRRSV的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic analysis of PRRSV based on Nsp2genes

2.3 Nsp2基因的推導(dǎo)的氨基酸序列分析

通過(guò)氨基酸序列的比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)部分NSP2序列的缺失部位是在全長(zhǎng)序列的高變區(qū)域部分（324 aa～876aa），為非連續(xù)缺失（482aa和534aa～562 aa）（圖3）。此外，在第47位到第240位的半胱氨酸水解酶功能區(qū)域基本上是保守的。在一些關(guān)鍵的位點(diǎn)中，如第55位的C，56位的G，124位的H和125位的W沒(méi)有發(fā)生突變。還有第111位，142位和147位的半胱氨酸也都保守（圖4）。

圖3 部分PRRSV毒株Nsp2的氨基酸缺失位置Fig.3 Location of deletion sites of amino acids in the Nsp2protein of representative PRRSV

圖4 部分PRRSV毒株Nsp2第47位到第240位氨基酸比較Fig.4 Comparison of amino acid sequences between 47aa－240aa of the Nsp2protein of representative PRRSV

3 討論

自20世紀(jì)末PRRS開(kāi)始暴發(fā)以來(lái)，已給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。臨床上導(dǎo)致妊娠母豬的流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎以及仔豬成活率下降和育肥豬的呼吸道疾病，常繼發(fā)其他病原感染［8］，混合感染的現(xiàn)象也較多［9］。我國(guó)自1996年開(kāi)始暴發(fā)PRRS，關(guān)于該病的報(bào)告與研究日漸增多［3，10］。有資料顯示，不同PRRSV分離毒株在毒力、基因序列和抗原性等方面存在較大的差異［11］，所以PRRSV的變異也在一定程度上導(dǎo)致本病更加難以防控。在ORF1編碼所有非結(jié)構(gòu)蛋白中，Nsp2變異程度最高，并且在北美洲型毒株和歐洲型毒株間存在著很大的差異。有報(bào)道指出，其氨基酸同源性低于40%［12－13］，明顯低于 PRRSV 其他非結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸同源性［14－15］。另有研究認(rèn)為 ORF1復(fù)制酶基因的變異與PRRSV的毒力致弱以及在MA104細(xì)胞上的復(fù)制增強(qiáng)有關(guān)［16］，使得Nsp2在近年來(lái)成為一個(gè)研究的熱點(diǎn)。

通過(guò)序列比對(duì)分析，41條基因之間的核苷酸同源性比較高，為89.2%～100.0%。其中毒株8－09－HZ68和23－09－JH71分別分離于杭州和金華，但是它們的核苷酸同源性為100%，說(shuō)明它們可能來(lái)源于同一毒株。從系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹(shù)中可知，PRRSV分離株可明顯分為歐洲型和北美洲型2個(gè)基因型。北美洲型中存在的2個(gè)亞群，這2個(gè)亞群在進(jìn)化關(guān)系上的差異正是由于30個(gè)氨基酸位點(diǎn)的缺失而形成的。亞群2中，本試驗(yàn)的21個(gè)非缺失株與國(guó)內(nèi)外分離的非缺失株存在于兩個(gè)明顯的分支上。本試驗(yàn)21個(gè)非缺失株之間核苷酸同源性為99.2%～100.0%，屬于高度同源，而與 VR－2332、CH－2002等經(jīng)典非缺失毒株Nsp2基因序列相似性?xún)H為81.1%～93.5%，說(shuō)明本試驗(yàn)分離的21個(gè)非缺失株與國(guó)內(nèi)外分離的非缺失株相比，已經(jīng)存在一定程度的變異，在進(jìn)化樹(shù)上顯示的親緣關(guān)系也漸行漸遠(yuǎn)。亞群1在進(jìn)化樹(shù)上沒(méi)有明顯的分布規(guī)律，在各個(gè)分支中均有分布。20個(gè)缺失株之間核苷酸同源性為94.2%～99.8%，與國(guó)內(nèi)報(bào)道PRRSV變異株Nsp2序列高度同源，高達(dá)98.2%～100%基本相符［17］。

有研究表明［18］，Nsp2高變區(qū)的基因缺失或者突變，對(duì)于PRRSV沒(méi)有影響，尤其是中國(guó)流行毒株中30個(gè)氨基酸的缺失，不會(huì)影響到PRRSV毒力的變化［19］。但是，在PL2的結(jié)構(gòu)域中，有一些關(guān)鍵的氨基酸位點(diǎn)，將影響病毒的復(fù)制及功能。比如第55位的C，56位的G，124位的H和125位的 W的突變，對(duì)于PRRSV來(lái)說(shuō)是致死性突變，而第111位，142位和147位的半胱氨酸則對(duì)于維持PL2的反式剪輯活性是必須的［18］。但是，這些位點(diǎn)在本試驗(yàn)毒株的基因序列中高度保守。另外，第26、80、174、198、201、209位氨基酸則變化較大。那么，是否可以推測(cè)，這些位點(diǎn)對(duì)于維持PL2這個(gè)重要的功能域的活性來(lái)說(shuō)，不是關(guān)鍵性位點(diǎn)呢？當(dāng)然，這還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證?？傊?，通過(guò)對(duì)浙江地區(qū)流行毒株的Nsp2基因序列分析，可以看出其高變性，但是一些關(guān)鍵位點(diǎn)依然保守。

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