韋 悠，謝芝勛，范 晴，劉加波，謝麗基，龐耀珊，鄧顯文，謝志勤

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005；2.廣西獸醫(yī)研究所 廣西畜禽疫苗新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530001）

禽I群腺病毒血清1型（Fowl adenovirus group I serum type 1，F(xiàn)AV－1）屬腺病毒科，雞腺病毒1型，歸屬腺病毒Ⅰ群，是其代表種。禽I群腺病毒感染以包涵體肝炎、再生障礙性貧血、呼吸道感染、出血性腸炎和產(chǎn)蛋量減少為主要特征，主要感染2周齡～8周齡的雞。該病發(fā)生后的一大特點(diǎn)是病原復(fù)雜，感染率高，常與引起禽類呼吸道疾病的病原微生物混合感染，導(dǎo)致死亡率增加［1－4］。已經(jīng)證明傳染性法氏囊病毒可以增強(qiáng)禽I群腺病毒的致病性，雞傳染性貧血病毒也可以提高禽腺病毒引起肝炎和致死的能力。自1954年Ates等首次從雞胚中分離到該病毒后，許多國家都先后報(bào)道了它的存在。陳溥言［5］的試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)AV－1已污染我國研究用和疫苗生產(chǎn)用非免疫蛋，周斌等［6］檢測結(jié)果也證實(shí)了這種污染的嚴(yán)重性。目前國內(nèi)外均無商品化的禽Ⅰ群腺病毒疫苗，該病毒的防控仍較為薄弱。本研究所研制的滅活油乳劑疫苗將為FAV－1感染的防控提供技術(shù)保障，對養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒株、雞胚和FAV－1陽性及陰性血清FAV－1種毒為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品；SPF雞胚為北京梅里亞公司產(chǎn)品；FAV－1陽性血清、陰性血清均由廣西獸醫(yī)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.1.2 佐劑 10號注射用白油為中國石化集團(tuán)杭州煉油廠產(chǎn)品；Tween－80及Span－80均為上海高維有限責(zé)任公司進(jìn)口分裝產(chǎn)品。

1.1.3 試驗(yàn)用動物 北京梅里亞公司的SPF來航雞胚由本實(shí)驗(yàn)室自行孵化，飼養(yǎng)于SPF隔離器至3周齡。1月齡非免疫雞三黃雞、蘆花雞由廣西南寧市某兩家養(yǎng)禽場提供。

1.2 方法

1.2.1 FAV－1增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.2.1.1 最佳接種劑量 按基礎(chǔ)種子批病毒TCID50分 別 為 104.4、105.4、106.4、107.4、108.4TCID50／mL將病毒通過絨毛尿囊膜接種于SPF雞胚，37℃孵育96h后收獲尿囊液。測定尿囊液中病毒粒子含量。

1.2.1.2 最佳收獲時間 將基礎(chǔ)種子批病毒（105.4TCID50／mL）通過尿囊膜接種于SPF雞胚，37℃孵育48、72、96、120、144h后收獲尿囊液，測定尿囊液量及尿囊液中病毒粒子含量。

1.2.2 滅活劑及滅活終濃度 將按謝芝勛方法［7－8］制備的抗原液（109.31、108.55、108.14TCID50／mL，病毒粒子 數(shù) 為108.74copies／mL）50mL 加 入 終 濃 度 為0.05、0.1、0.5、1、3、5mL／L的甲醛，置于37℃滅活16h。再將另50mL抗原液加入終濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03mL／L的β－丙內(nèi)酯（β－propionolactone，BPL），置于20℃滅活16h。將滅活后的抗原液接種SPF雞胚，盲傳2代后檢測是否有病毒增殖。

1.2.3 最佳成分比例的研究

1.2.3.1 親油親水平衡值的確定 按謝芝勛計(jì)算方法［9］，制備親油親水平衡值（hydrophile－lipophile balance，HLB）分別為5.0、6.0、7.0、8.0的4組疫苗，置于4℃及20℃保存檢測其穩(wěn)定性。將4組疫苗分別免疫3周齡SPF雞，每組10羽。測定其免疫后2、3、4、6、8周后的抗體水平，比較HLB值對抗體效價及穩(wěn)定性的影響。

1.2.3.2 乳化劑含量的確定 按最佳HLB值的Span－80與Tween－80的比例，制備乳化劑含量分別為2.5%、5%、10%、15%的4組疫苗，置于4℃及20℃保存檢測其穩(wěn)定性。4組疫苗分別免疫3周齡SPF雞，每組10羽。免疫后2、3、4、6、8周后測定抗體水平，比較不同乳化劑含量對穩(wěn)定性及抗體水平的影響。

1.2.3.3 油水比的確定 按照最佳HLB及乳化劑含量，制備油水比分別為3∶1、4∶1、5∶1、9∶1的四組疫苗，同樣進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。將4組疫苗分別免疫3周齡SPF雞，每組10羽。比較其免疫后2、3、4、6、8周后的抗體水平。

1.2.4 滅活疫苗的乳化制備 按比例將抗原與滅菌Tween－80預(yù)混成水相；將白油與Span－80預(yù)混滅菌后為油相。使用ATS均質(zhì)機(jī)，在500Pa的壓力下進(jìn)行切割混合3次，即為滅活疫苗成品。

1.2.5 疫苗性狀檢驗(yàn)

1.2.5.1 劑型檢測 觀察成品疫苗外觀，將疫苗滴于盛有清潔冷水的平皿，觀察疫苗滴擴(kuò)散情況，判定其劑型。

1.2.5.2 穩(wěn)定性 取滅活疫苗成品5mL離心3 000r／min 15min后，觀察其外觀性狀，是否有分層及抗原析出現(xiàn)象。

1.2.5.3 黏度測定 用上口內(nèi)徑為2.7mm，下口內(nèi)徑為1.2mm的1mL玻璃吸管吸滿25℃ 的1 mL成品疫苗，記錄垂直釋放出0.4mL所需要的時間。

1.2.5.4 無菌檢驗(yàn) 將滅活過的抗原液、白油、乳化劑及制成的成品疫苗接種于普通LB肉湯、厭氧肉湯及普通瓊脂、血液瓊脂等培養(yǎng)基，分別放置37℃培養(yǎng)24h和25℃進(jìn)行培養(yǎng)7d，觀察有無微生物生長。

1.2.5.5 安全性檢測 免疫3周齡SPF雞5羽，每羽通過頸背部皮下注射疫苗2mL（4羽份），免疫14d后進(jìn)行觀察及解剖，記錄是否出現(xiàn)由免疫注射引起的局部和全身反應(yīng)。

1.2.5.6 保存期檢測 3個批次疫苗分別保存于4℃、20℃及37℃，觀察12個月。逐月觀察其外觀性狀，記錄其分層、析出情況。

1.2.5.7 最小免疫劑量試驗(yàn) 將3周齡SPF白航雞分為7組，每組4羽。其中1～5組分別免疫FAV－1滅活苗25、50、100、250、500μL；第6組為不免疫攻毒對照組；第7組為空白對照組。在免疫后3周采集所有雞的血清測定抗體水平，對1～6組的試驗(yàn)雞進(jìn)行攻毒，每羽雞攻毒0.2mL FAV－1病毒液（108.14TCID50／mL， 病 毒 粒 子 數(shù) 為 108.74copies／mL）。于攻毒后3、5、7、10、14d分別采集咽喉及泄殖腔棉拭子，檢驗(yàn)是否出現(xiàn)排毒。

1.2.6 疫苗免疫抗體水平的監(jiān)測 將3周齡SPF白航雞分為2組，每組20羽。第1組為免疫組，每羽雞免疫本研究所制備的FAV－1滅活油乳劑疫苗0.5mL（含病毒粒子106.615copies）；第2組為空白對照組，不進(jìn)行免疫。于免疫前及免疫后的第2、3、4、6、8周分別采集每羽雞的血清。采用FAV－1全病毒包被間接ELISA方法進(jìn)行抗體水平測定。

1.2.7 免疫攻毒試驗(yàn) 將3周齡SPF白航雞分為3組。第1組為免疫攻毒組，共20羽，每羽雞免疫本研究所制備的FAV－1滅活油乳劑疫苗0.5mL（含病毒粒子106.615copies），在免疫后的第3周通過肌肉 注 射 0.1mL 的 FAV－1 病 毒 液 （108.14TCID50／mL，病毒粒子數(shù)為108.74copies／mL）進(jìn)行攻毒。并于攻毒后的3、5、7、10、14d采集所有雞的咽喉及泄殖腔棉拭子，PCR檢驗(yàn)是否出現(xiàn)排毒陽性。

第2組為攻毒對照組，共20羽。不進(jìn)行疫苗免疫。與免疫攻毒組同時通過肌肉注射0.1mL的FAV－1病 毒 液 （108.14TCID50／mL，病 毒 粒 子 數(shù) 為108.74copies／mL）進(jìn)行攻毒。并于攻毒后的3、5、7、10、14d采集所有雞的咽喉及泄殖腔棉拭子，PCR檢驗(yàn)是否出現(xiàn)排毒陽性。

第3組為空白組，共10羽。與免疫攻毒組及攻毒對照組同時采集所有雞的咽喉及泄殖腔棉拭子，PCR檢驗(yàn)是否出現(xiàn)排毒陽性。

1.2.8 田間試驗(yàn) 將廣西南寧市郊區(qū)某2家蛋雞養(yǎng)殖場所養(yǎng)殖1月齡三黃雞3 000只、蘆花雞3 000只作為田間試驗(yàn)所用動物，通過頸背部皮下注射的方式進(jìn)行免疫接種所研制疫苗0.5mL／羽。在免疫后的1、2、3、4、5、6月分別隨機(jī)抽查取50只免疫雞的血清，通過FAV－1全病毒間接ELISA方法檢測免疫抗體水平。

2 結(jié)果

2.1 FAV－1最佳增殖條件優(yōu)化

經(jīng)優(yōu)化可知，當(dāng)接種劑量為105.4TCID50／mL時可獲得最高病毒粒子濃度的抗原液；在接毒后72 h～96h病毒毒價達(dá)峰值，平均尿囊液收獲量為8.7mL／胚，因此將這段時間確定為尿囊液最佳收獲期。

2.2 滅活劑及滅活終濃度

使用終濃度為1、3、5mL／L的甲醛滅活16h，病毒液盲傳2代后沒有出現(xiàn)病毒增殖；0.05、0.1、0.5mL／L終濃度滅活的病毒液盲傳2代后病毒發(fā)生增殖。將病毒液使用終濃度為0.5mL／L和1 mL／L的BPL滅活16h，進(jìn)行2代盲傳后檢測沒有增殖病毒；使用0.25、0.125、0.06、0.03mL／L終濃度的BPL在盲傳后發(fā)生病毒增殖。因此，本研究確定滅活使用1mL／L終濃度的甲醛或0.5mL／L終濃度的BPL。

2.3 疫苗成分最佳配比

2.3.1 HLB確定 當(dāng)FAV－1滅活油苗的HLB值為7.0，Span－80與 Tween－80比例為3∶1時，該組（組3）油苗免疫SPF雞后血清抗體的ELISA OD450值最高，且放置于4℃及20℃兩個月不分層，且無抗原析出現(xiàn)象。從效價上看4組免疫的抗體水平差異不顯著（P＞0.05），可知HLB值主要影響疫苗溶液的穩(wěn)定性（表1）。

2.3.2 乳化劑含量確定 當(dāng)油苗的乳化劑含量為10%時，第3組油苗免疫SPF雞免疫后血清抗體的ELISA OD450值最高，放置于4℃及20℃保存2個月內(nèi)均無出現(xiàn)抗原析出及分層。第1、4組在免疫后8周抗體水平迅速下降，組別間差異不顯著（P＞0.05），見表2。

2.3.3 油水比確定 FAV－1滅活油苗的油水比為4∶1時，第2組油苗免疫SPF雞免疫后血清抗體的ELISA OD450值最高，且放置于4℃及20℃保存2個月均無出現(xiàn)抗原析出及分層。第4組在30d內(nèi)迅速出現(xiàn)分層并有抗原析出，在免疫后6周起出現(xiàn)了抗體水平的迅速下降。第4組與第1、2、3組之間差異及其顯著（P＜0.01），見表3。

2.4 疫苗性狀檢驗(yàn)

2.4.1 疫苗的劑型 疫苗為白色狀乳液，顯微鏡下觀察質(zhì)地均一，無顆粒狀雜質(zhì)。將疫苗滴于裝有清潔室溫水的平皿中，疫苗成水滴狀漂浮于水面，邊緣圓滑規(guī)整，表明該劑型為油包水劑型。

2.4.2 穩(wěn)定性檢測 將5mL疫苗3 000r／min離心15min，均無出現(xiàn)水相析出、分層。

2.4.3 黏度測定 使用1mL的吸管吸取FAV－1滅活疫苗1mL，使其自然垂直流出，流出0.4mL疫苗的平均時間為5s，在規(guī)定的油苗黏度范圍內(nèi)。

表1 親油親水平衡值對FAV－1油苗免疫效果的影響Table 1 Vaccination effect of chicken following administration of FAV－1oil emulsions with varing hydrophile－lipophile balance（HLB）

表2 不同乳化劑含量對FAV－1油苗免疫效果的影響Table 2 Vaccination effect of chicken following administration of FAV－1oil emulsions with varing constant volume of surfactant quantity

表3 不同油水比對FAV－1油苗免疫效果的影響Table 3 Vaccination effect of chicken following administrationof FAV－1oil emulsions with varing antigen aqueous－phase

2.4.4 無菌檢驗(yàn) 接種過后的普通LB肉湯、厭氧肉湯及普通瓊脂、血液瓊脂等培養(yǎng)基均無微生物的生長，證明制備疫苗所用佐劑及疫苗成品均無微生物污染。

2.4.5 安全性試驗(yàn) 將5只SPF雞免疫1mL（2羽份）的滅活疫苗后觀察14d并解剖，沒有出現(xiàn)任何由疫苗注射引起的局部和全身反應(yīng)，注射部位吸收良好，無肌肉壞死現(xiàn)象。

2.4.6 保存期試驗(yàn) 將三個批次的疫苗分別保存于4℃、20℃及37℃，觀察12個月。逐月觀察其外觀性狀，記錄其分層、析出情況（表4）。

2.4.7 最小免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果 將咽喉及泄殖腔棉拭子排毒的結(jié)果表5所示，免疫劑量為0.25mL時產(chǎn)生的抗體，能完全抵抗 TCID50為108.14TCID50／mL、病毒粒子濃度為107.615copies／mL 的FAV－1攻擊，所以本試驗(yàn)將0.25mL確定為所研究疫苗的最小免疫劑量，并提示當(dāng)免疫抗體水平為0.565及以上時，足夠抵抗病毒的侵害而不產(chǎn)生排毒（表5）。

表4 疫苗保存期試驗(yàn)Table 4 Test of vaccine preseving time

表5 最小免疫劑量試驗(yàn)結(jié)果Table 5 The result of minimum immune dose test

2.5 疫苗免疫抗體水平檢測結(jié)果

抗體免疫水平測定結(jié)果如圖1所示，在免疫后第2周開始進(jìn)行免疫抗體水平的檢測。在免疫后的第4周免疫雞組的抗體水平達(dá)到了最高峰ELISA OD4500.96。而從免疫后第4周開始，抗體水平緩慢滑落，在免疫后第8周時維持ELISA OD4500.731的水平（圖1）。

2.6 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果

攻毒后免疫攻毒組雞沒有出現(xiàn)臨床癥狀，從攻毒后的第3天至第14天的咽喉及泄殖腔棉拭子沒有出現(xiàn)咽喉、泄殖腔排毒現(xiàn)象。攻毒對照組在攻毒后3d時，20只雞中有19只出現(xiàn)排毒現(xiàn)象，一直持續(xù)到攻毒后的第14天。FAV－1滅活油乳劑疫苗對免疫組雞的保護(hù)率為100%，達(dá)到完全抵抗病毒的攻擊（表6和表7）。

2.7 田間試驗(yàn)

檢測結(jié)果如圖2所示，在免疫初期FAV－1油苗抗體達(dá)到預(yù)期免疫抗體水平，在免疫后4個月內(nèi)保持高效價。而在免疫后5個月抗體水平出現(xiàn)下降，到免疫后6個月時保持在中等水平。試驗(yàn)結(jié)果證明該疫苗達(dá)到了試驗(yàn)預(yù)期水平，能較好的誘導(dǎo)雞體產(chǎn)生FAV－1抗體。

表6 FAV－1病毒攻毒試驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄Table 6 Data of FAV－1challenge test

表7 FAV－1病毒攻毒試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 7 The statistics result of FAV－1challenge test

圖1 FAV－1滅活苗免疫抗體水平ELISA檢測結(jié)果Fig.1 The detection result of antibody level of FAV－1 inactivated oil－emulsion vaccine by ELISA

圖2 FAV－1滅活油乳劑苗免疫抗體水平檢測Fig.2 The detection of antibody level of FAV－1 inactived oil－emulsion vaccine by ELISA

3 討論

病毒分離、PCR診斷或病毒特異性抗體的存在均證明了FAV－1在健康雞和病雞中普遍存在［10］，目前為止國內(nèi)沒有任何用于預(yù)防FAV－1感染的疫苗。滅活疫苗具有安全性高，不易散毒且免疫效果好等特點(diǎn)。因此，本研究選用滅活油苗的劑型來進(jìn)行FAV－1疫苗的研制。

甲醛是目前國內(nèi)獸用滅活疫苗常用的一種滅活劑。其以成本低，滅活效果好為優(yōu)點(diǎn)。但是對于機(jī)體刺激性大，對蛋雞產(chǎn)蛋有一定的影響。且甲醛本身帶有毒性，過高的滅活終濃度易使動物產(chǎn)生甲醛中毒。β－丙內(nèi)酯 （BPL）［11－16］是一種雜環(huán)化合物，是目前國外疫苗常用的滅活劑，對病毒具有很強(qiáng)的滅活作用，比甲醛的作用強(qiáng)25倍，而且對病毒表面抗原影響或破壞作用較小，其作用機(jī)制通過與嘌呤堿基（主要是鳥嘌呤）反應(yīng)改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活病毒的目的。本研究對兩種滅活劑的滅活應(yīng)用均進(jìn)行了研究，對生產(chǎn)上成本計(jì)算給予一定空間。

本研究從親油親水平衡值、乳化劑含量、油水比三個方面探討了油乳劑苗成分的比例對其穩(wěn)定性及免疫效果上的影響。①親油親水平衡值由油苗的乳化劑組分HLB平衡值所決定，它對油包水油苗的油苗中抗原的釋放和穩(wěn)定性有影響。本試驗(yàn)得出滅活疫苗HLB值7.0為最佳，為疫苗的制備提供了參考意見。②乳化劑含量對穩(wěn)定性和抗原的釋放快慢有決定性的作用。當(dāng)疫苗內(nèi)乳化劑含量少時，疫苗將抗原迅速釋放，在免疫初期是迅速引起抗體升高，而后期不足，免疫保護(hù)期相對較短。為了保證疫苗的免疫有效期，本研究測定出使用10%的乳化劑可以使抗原緩慢而有效的釋放，使抗體在一定時間內(nèi)保持中高水平。③疫苗中油水比決定了疫苗中抗原的含量及疫苗體系的穩(wěn)定性，如果疫苗中含有的抗原量過多，會由于機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生免疫抗體的極限而造成抗原的浪費(fèi)，增加不必要的成本。而疫苗中抗原過少則會導(dǎo)致免疫抗體的分泌持續(xù)時間不長，免疫抗體水平不高，甚至是產(chǎn)生的抗體水平不足以抵抗病毒的侵害。本試驗(yàn)中使用4∶1的配比，能夠保證疫苗中含有足夠量的抗原來誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生且不造成抗原的浪費(fèi)。

免疫抗體水平的監(jiān)測結(jié)果顯示，本研究所研制疫苗能夠較好的誘導(dǎo)免疫抗體的產(chǎn)生，在免疫后4周時達(dá)到最高峰，且在免疫后8周時維持高水平的免疫抗體。田間試驗(yàn)表明在大型養(yǎng)殖場中大批量的在不同品種雞中應(yīng)用本課題所研制疫苗所產(chǎn)生免疫效果與SPF白航雞試驗(yàn)相似，能達(dá)到預(yù)期免疫抗體水平且雞群中未出現(xiàn)食欲不振、產(chǎn)蛋下降或死亡，與未免疫雞群相比并無差異，安全性好。綜上所述，本研究所研制疫苗安全性好，保存期長，保護(hù)效果顯著。

［1］殷 震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)出版社，1997.

［2］SziIvia L，Benk P，F(xiàn)arkas M，et al.Genomic and phylogenetic analyses of an adenovirus isolated from a corn snake imply a common origin with members of the proposed new genus at adenovirus［J］.J General Virol，2002，83：2303－2310.

［3］Duncan J.Integrating reptilian herpesviruses into the family herpesviridae［J］.J Virol，2005，79（2）：725－731.

［4］Fauquet C M，Maniloff J，Mayo M A，et al.Virus taxonomies 8th report of ICTV［M］.Amsterdaml：Elsevier Academic Press，2005.

［5］陳溥言.禽腺病毒I型（雞胚致死孤兒病毒）在非免疫雞胚中隱性感染可能己經(jīng)嚴(yán)重危害到我國疫苗生產(chǎn)［J］.中國家禽，2002，24（14）：43.

［6］周斌.雞胚致死孤兒病毒的分離鑒定及其Ⅲa蛋白的原核表達(dá)的抗原性的分析［D］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2003.

［7］Xie Z X，Stone H D.Irnmune response to oil－emulsion vaccine single or mixed antigens of Newcastle diseases，avian influenza and inflectious bronchitis［J］.Avi Dis，1990，34：154－162.

［8］謝芝勛，劉加波.手工乳化制備新城疫油乳劑苗的試驗(yàn)［J］.中國獸醫(yī)科技，2001，31（8）：24－25.

［9］謝芝勛，劉加波.親油親水平衡值對雞新城疫油苗免疫力影響的研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2001，23（4）：128－129.

［10］Esther S，Ron J.Specific－pathogen－free chickens vaccinated with a live fadV－4vaccine are fully protected against a severe challenge ever in the absence of neutralizing antibodies［J］.Avi Dis，2010，54（2）：905－910.

［11］陳 偉，李忠義，劉江秋，等.β－丙內(nèi)酯在Vero細(xì)胞HFRS疫苗中的應(yīng)用［J］.中國公共衛(wèi)生，2003，19（6）：669－670.

［12］劉 兆，文李福，安錢浩，等.β－丙內(nèi)酯在人用純化地鼠腎細(xì)胞狂犬疫苗制備中的應(yīng)用研究［J］.中國人獸共患病雜志，1999，15（6）：71－72.

［13］李福安，竇志勇，魯 宏.β－丙內(nèi)酯在人用狂犬病疫苗制備中的應(yīng)用［J］.中國生物制品學(xué)雜志，1999，12（1）：7－8.

［14］Lawrence S A.β－propiolactone：Viral inactivation in vaccines and plasma products［J］.PDA J Pharm Sci Technol，2000，54：209.

［15］Perrin P，Morgeaux S.Inactivation of DNA by beta－propiolactone［J］.Biologicals，1995：23（3）：207.

［16］張松樂，馬麗娟，田 光，等.SARS2CoV的培養(yǎng)和滅活條件的研究［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2005，19（2）：135－140.