李曉昱 梁曉飛 朱明潔 孫彥明 段友容

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院腫瘤研究所，上海交通大學(xué)腫瘤研究所, 上海 200032

基因療法是治療腫瘤的新手段［1-2］。但目前面臨的主要障礙是缺乏合適的基因治療載體［3-4］。由于病毒性基因載體存在導(dǎo)向性差、攜帶能力低、免疫原性和潛在致瘤性等缺點(diǎn)［5］。因此，針對(duì)其缺點(diǎn)研制非病毒載體近來(lái)成為研究的熱點(diǎn)，主要包括真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒載體、陽(yáng)離子聚合物［6-7］、陽(yáng)離子脂質(zhì)體［8］和聚合物嵌段共聚物等。

殼聚糖是一種天然無(wú)毒的多糖，具有良好的生物降解性和生物相容性，并通過吸附DNA保護(hù)其免受酶的降解［2］。殼聚糖骨架上豐富的氨基和羥基使其易于化學(xué)修飾，有利于進(jìn)一步提高遞送基因的效率［9］。已有許多體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，殼聚糖及其衍生物是非病毒基因載體的合適材料［10］。含有長(zhǎng)鏈烷基的親水性羧甲基殼聚糖季銨鹽具備了更好的溶解性和乳化性。這些性狀的改變，使其更加適合作為基因轉(zhuǎn)染材料。

本研究在模擬普通的陽(yáng)離子脂質(zhì)體基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，將脂質(zhì)體技術(shù)與納米聚合物膠束技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建新型陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體(CPL)系統(tǒng)，并將其作為基因載體，探討其基因轉(zhuǎn)染效率及動(dòng)物體內(nèi)分布，爭(zhēng)取最大限度地提高載體的基因轉(zhuǎn)染效率。其中CPL采用以殼聚糖季銨鹽為主體，選取長(zhǎng)鏈不同烷基數(shù)目的殼聚糖季銨鹽，探討不同結(jié)構(gòu)的殼聚糖季銨鹽對(duì)轉(zhuǎn)染效率的影響。本研究通過檢測(cè)CPL納米粒在3種不同荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布，為非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染和基因治療提供有科學(xué)價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

殼聚糖，具有99%脫乙酰度和相對(duì)分子質(zhì)量約為5×104和1×105，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。十八烷基二甲基氯化銨甘油酯(QA)由本實(shí)驗(yàn)室制備。質(zhì)粒DNA(pEGFP-C1質(zhì)粒和pGL3-對(duì)照載體)由本實(shí)驗(yàn)室保存，提取自培養(yǎng)的大腸埃希菌，質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自Macherey-Nagel公司。瓊脂糖凝膠(0.8%)電泳分析表明，其以超螺旋質(zhì)粒的形式為主。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。3-(4,5二甲基-2-噻唑)-2，5-diphenyltetrazolium溴(MTT)購(gòu)自Amresco公司。6～7周齡BALB/c裸鼠由上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。其他所有的培養(yǎng)液和細(xì)胞培養(yǎng)中使用試劑均購(gòu)自Hyclone公司。其他化學(xué)品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，并未進(jìn)一步的純化。

1.2 CPL納米粒的制備與表征

1.2.1 CPL的制備

根據(jù)長(zhǎng)鏈烷基數(shù)目不同，分別選取十二烷基二甲基氯化銨甘油酯、十四烷基二甲基氯化銨甘油酯、十六烷基二甲基氯化銨甘油酯、十八烷基二甲基氯化銨甘油酯為原料，根據(jù)文獻(xiàn)［11-13］的方法，制備十二烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(DQCMC)、十四烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(TQCMC)、十六烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(CQCMC)、十八烷基-羧甲基殼聚糖季銨鹽(OQCMC)嵌段共聚物，相對(duì)分子質(zhì)量為2×104g/mol，季銨鹽的接枝率是105.0%。

1.2.2 CPL納米粒的制備

采用薄膜分散法制備CPL的過程如下：按照質(zhì)量比5∶4的比例，精確稱取殼聚糖季銨鹽和膽固醇10 mg和8 mg，加入到50 mL茄形瓶中，溶于2 mL氯仿中，然后在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行旋蒸，同時(shí)向旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中通入適當(dāng)流速的氮?dú)饬骷右员Ｗo(hù)。當(dāng)茄形瓶中形成一層透明均勻的脂質(zhì)膜后，繼續(xù)旋蒸15 min，稍微干燥后， 向茄形瓶中加入2 mL去離子水，將脂質(zhì)膜水化，然后用超聲波清洗器以99 w的功率進(jìn)行超聲分散，直至形成半透明乳液，即得到陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體溶液。

1.2.3 DNA/CPL納米粒的制備

DNA和CPL納米粒分別用Opti-MEM 100 μL稀釋。室溫下靜置10 min，漩渦震蕩3～5 s后，繼續(xù)靜置20 min，使DNA與納米粒緊密吸附在一起。

1.2.4 CPL納米粒的表征

利用動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀(NICOMP 380 ZLS Zeta Potential/Particle Sizer, PSS Nicomp, and Santa Barbara, CA,USA)測(cè)定納米粒粒徑分布。所有的測(cè)量均在25℃時(shí)進(jìn)行，測(cè)量角度為90°。

利用透射電子顯微鏡(TEM，HITACHI H-7650，Japan)觀察納米粒的形貌。用鑷子小心取出碳膜銅網(wǎng)，將膜面朝上(在燈光下觀察顯示有光澤的面，即膜面)，輕輕平放在白色濾紙上；然后滴2～3滴該混合液體到碳膜銅網(wǎng)上，至網(wǎng)上形成飽滿水滴而不流下為宜。靜置2～3 min后用濾紙?jiān)诰W(wǎng)下吸去多余水分，室溫干燥5 min。磷鎢酸染色10～20 min后，透射電子顯微鏡下觀察。

1.3 TQCMC納米粒細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

以1×104細(xì)胞/孔的密度將L929細(xì)胞接種到96孔板中，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下溫育24 h后，分別加入20 μL終濃度分別為1、10、20、50、100 μg/mL的TQCMC，DNA/TQCMC，LipofectamineTM2000，DNA LipofectamineTM2000培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，37 ℃繼續(xù)溫育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸取孔內(nèi)培養(yǎng)上清液后，每孔加入150 μL DMSO，溫育30 min。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀(Bio-RAD Model 550)上測(cè)定各孔吸光值。細(xì)胞活性按下列公式計(jì)算。

1.4 CPL納米粒體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將5×104個(gè)細(xì)胞接種到24孔板中，在37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%條件下溫育18～24 h后至細(xì)胞融合度為70%～80%。轉(zhuǎn)染前將完全培養(yǎng)基吸去，用PBS洗滌2次，加入500 μL無(wú)血清培養(yǎng)基。分別將0.8 μg EGFP或者PGL3質(zhì)粒DNA和不同質(zhì)量比的TQCMC納米粒溶解與100 μL的opti-MEM培養(yǎng)液中，靜置5 min。再將兩者輕柔混合，室溫靜置20 min。將該混合物加入培養(yǎng)孔中溫育3 h后，置換無(wú)血清培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter Epics XL)檢測(cè)或按照熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(碧云天)所 提供的說明書在promega-20/20化學(xué)發(fā)光儀上檢測(cè)光子的強(qiáng)度。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)檢測(cè)出總蛋白的濃度，從而將結(jié)果統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化成RLU/(mg·mL-1)蛋白(每毫克蛋白所對(duì)應(yīng)的相對(duì)光子數(shù))。

1.5 荷瘤裸鼠模型的構(gòu)建

分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞、人卵巢癌HO8901細(xì)胞、人前列腺癌PC-3細(xì)胞于每只裸鼠(共54只)右后下肢皮下接種5×106/0.2 mL。確保皮丘飽滿無(wú)漏液，接種后每天觀察注射點(diǎn)有無(wú)紅腫破潰及裸鼠的一般情況。接種后14～20 d左右，接種點(diǎn)無(wú)紅腫、破潰。裸鼠形成單一皮下移植瘤，直徑約1.0 cm，即為模型構(gòu)建成功。

1.6 TQCMC納米粒在裸鼠體內(nèi)分布

分別將荷人乳腺癌MDA-MB-231、人卵巢癌HO8901、人前列腺癌PC-3裸鼠18只，稱重并隨機(jī)分為3組：DNA/CPL組(簡(jiǎn)稱CPL組，DNA與CPL質(zhì)量比為1∶4)、DNA/LipofectamineTM2000(簡(jiǎn)稱LipofectamineTM2000組，DNA與LipofectamineTM2000質(zhì)量比為1∶1)、質(zhì)粒DNA組(簡(jiǎn)稱質(zhì)粒組)。每組6只，每只尾靜脈分別注射相應(yīng)的試劑200 μL(含質(zhì)粒DNA 40 mg溶于MEM培養(yǎng)液中)，于注射后48 h將3組裸鼠處死。每只裸鼠均取出肝、脾、腎、心、肺和腫瘤，用濾紙吸凈組織所帶血液，稱取組織的重量后放入EP管中。均漿組織后立即測(cè)定各組織的熒光素酶強(qiáng)度(RLU值)，并用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)出總蛋白的濃度，從而將結(jié)果統(tǒng)一為RLU/(mg·mL-1)蛋白(每毫克蛋白所對(duì)應(yīng)的相對(duì)光子數(shù))。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用表示，各組間差異用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CPL的形態(tài)、粒徑大小

經(jīng)過透射電鏡觀察，CPL納米粒大小均勻，形態(tài)規(guī)整。動(dòng)態(tài)光散射粒度分析儀檢測(cè)得出，DQCMC、TQCMC、CQCMC和OQCMC的粒徑分別為114.5、120.5、125.1和170.1 nm。由此可知CPL的粒徑均在100～200 nm之間，并且隨著長(zhǎng)鏈烷基數(shù)目的增加，納米粒粒徑逐漸增大。

2.2 CPL的體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以熒光素酶載體pGL3-control為報(bào)告基因來(lái)觀察不同CPL對(duì)PC-3和293T細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染的情況。由圖1可見，CPL作為一種良好的基因載體，具有較高的轉(zhuǎn)染強(qiáng)度。其中尤以DQCMC和TQCMC轉(zhuǎn)染效果最佳，對(duì)于PC-3細(xì)胞達(dá)到106RLU/(mg·mL-1)，對(duì)于293T細(xì)胞達(dá)到109RLU/(mg·mL-1)。但是由于TQCMC較DQCMC在制備過程中產(chǎn)率更大，更易獲得，因此以下實(shí)驗(yàn)均選取TQCMC為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

按照D N A與T Q C M C質(zhì)量比1∶4的比例，以LipofectamineTM2000為陽(yáng)性對(duì)照，以EGFP質(zhì)粒DNA為陰性對(duì)照，分別進(jìn)行TQCMC納米粒對(duì)人胃腺癌細(xì)胞SGC7901、293T、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721和人卵巢癌細(xì)胞HO8901進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)(圖2)，TQCMC納米粒的轉(zhuǎn)染效率雖然較LipofectamineTM2000略差，但在HO8901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，可作為一種有效的基因轉(zhuǎn)染載體。

2.3 TQCMC納米粒細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

納米粒與L929細(xì)胞作用4 h后，根據(jù)MTT試驗(yàn)計(jì)算生存率，當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí)，TQCMC納米粒的生存率為76.15%，而LipofectamineTM2000已降至17.95%。與DNA復(fù)合后，納米粒的生存率略有下降，但仍較LipofectamineTM2000細(xì)胞毒性小(圖3)。MTT試驗(yàn)結(jié)果與顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察基本吻合。

2.4 TQCMC納米載體在裸鼠體內(nèi)的分布

與LipofectamineTM2000相比，在荷人乳腺癌MDAMB-231裸鼠體內(nèi)TQCMC納米粒主要分布在心臟、腎臟和腫瘤組織中(圖4A)。TQCMC納米載體在荷人卵巢癌HO8901裸鼠體內(nèi)主要集中在肺臟、心臟、腎臟和腫瘤組織中(圖4B)。TQCMC納米載體在荷人前列腺癌PC-3裸鼠體內(nèi)分布于心臟、肝臟、肺臟和腫瘤組織中(圖4C)。但有一點(diǎn)值得注意，無(wú)論是陽(yáng)性對(duì)照LipofectamineTM2000組還是實(shí)驗(yàn)組CPL組，與陰性對(duì)照質(zhì)粒組的體內(nèi)分布差異很小。

3 討 論

目前很多殼聚糖的衍生物就是針對(duì)基因載體的要求進(jìn)行制備的，殼聚糖季銨鹽就是其中之一。殼聚糖季銨鹽的種類有很多。高分子脂質(zhì)體水溶液中不易發(fā)生融合，穩(wěn)定性好，同時(shí)含有氨基和羧基等官能團(tuán)，容易進(jìn)行多功能化組裝［14］。TQCMC替代磷脂，成功制備了表面帶正電并含有氨基等官能團(tuán)的陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體TQCMC。以TQCMC為主體所構(gòu)成的陽(yáng)離子高分子脂質(zhì)體所采用的原料殼聚糖和季銨鹽等，較易得到、價(jià)格低廉。相對(duì)于價(jià)格昂貴的LipofectamineTM2000，CPL成本的降低使其在各個(gè)領(lǐng)域大規(guī)模的應(yīng)用成為可能。

影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多，如培養(yǎng)基pH值、轉(zhuǎn)染時(shí)間、細(xì)胞種類、納米粒粒徑等［15］。本實(shí)驗(yàn)所制備的納米粒均在100～200 nm之間，且隨著長(zhǎng)鏈烷基數(shù)目的增加粒徑逐漸增大。粒徑再此區(qū)間的納米粒多可通 過胞吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，增強(qiáng)轉(zhuǎn)染效果。

基因載體的生物安全性一直以來(lái)備受關(guān)注。由MTT實(shí)驗(yàn)可以看出，與LipofectamineTM2000相比，TQCMC的生物毒性明顯下降，其安全濃度有了顯著提高，為其在體內(nèi)廣泛應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。為了驗(yàn)證TQCMC轉(zhuǎn)染效率的廣適性，本研究針對(duì)4種不同的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。與LipofectamineTM2000相比，TQCMC的轉(zhuǎn)染效率仍有一定差距；但對(duì)于人卵巢癌HO8901細(xì)胞來(lái)說，TQCMC納米?？梢赃_(dá)到38.9%。由于納米顆粒表面含有氨基等官能團(tuán)，因此很容易采用多種方法增強(qiáng)載體的基因轉(zhuǎn)染效率。如使用靶向試劑對(duì)其進(jìn)行表面修飾而制備具有組織、細(xì)胞膜或細(xì)胞核靶向功能的納米基因載體系統(tǒng)；使用跨膜肽的修飾則可提高納米粒的跨細(xì)胞膜功能；也可將具有質(zhì)子海綿效應(yīng)的PEI復(fù)合到高分子脂質(zhì)體當(dāng)中。

能否在體內(nèi)有效遞送基因是制約基因治療的瓶頸。雖然近年來(lái)許多非病毒載體發(fā)展迅猛，體外轉(zhuǎn)染效率有了很大提高，但生物安全性和體內(nèi)基因表達(dá)等問題大大阻礙了非病毒載體在臨床上的應(yīng)用。由TQCMC納米粒的裸鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于不同腫瘤模型的裸鼠，TQCMC納米粒的分布有所區(qū)別，但總體而言，主要分布在肝臟，腎臟和腫瘤組織中，體現(xiàn)了TQCMC納米的代謝途徑。同時(shí)由于腫瘤組織特有的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect，EPR)，粒徑在150 nm左右的納米粒容易聚集在腫瘤組織內(nèi)，實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向。但是TQCMC納米粒與裸質(zhì)粒DNA組相比，其組織內(nèi)的富集并不高。這也說明了體內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性。設(shè)計(jì)并制備安全無(wú)毒，且能夠在體內(nèi)高效遞送基因的非病毒載體還有很多需要解決的問題。

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