621100 四川省三臺縣人民醫(yī)院 楊勇瓊

310002 南京軍區(qū)杭州療養(yǎng)院海勤療養(yǎng)區(qū) 周曉明

310015 杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院 王建軍

結(jié)核病仍然是危害全球公眾健康問題的主要原因之一，全球每年有新發(fā)結(jié)核病人800萬，200萬人因結(jié)核病死亡[1-2]。在過去幾十年里，結(jié)核病與糖尿病的相關(guān)性受到廣泛關(guān)注，大量的回顧性研究表明糖尿病患者對結(jié)核病具有高度易感傾向，糖尿病是結(jié)核發(fā)生及耐多藥的重要危險因素之一[3]。

盡管有眾多證據(jù)顯示糖尿病會引起患者顯著增加對肺結(jié)核的易感性，但是目前關(guān)于糖尿病患者易感肺結(jié)核的免疫機制的報道尚少。有研究者發(fā)現(xiàn)糖尿病合并肺結(jié)核患者PBMC分泌細胞因子水平發(fā)生改變，表現(xiàn)為Th1/Th2比例下降[4]。在宿主抗結(jié)核免疫中，Th1細胞能介導(dǎo)巨噬細胞活化來抑制結(jié)核桿菌感染。糖尿病合并肺結(jié)核患者PBMC是否存在一定的免疫功能缺陷，目前國內(nèi)尚無相關(guān)報道。本實驗通過檢測糖尿病合并肺結(jié)核患者體內(nèi)巨噬細胞活化程度及巨噬細胞殺滅結(jié)核桿菌能力等來明確上述問題。

1 材料和方法

1.1 人外周血標(biāo)本 研究對象均來自2009-02—2010-02重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院肺科收治的新發(fā)和復(fù)發(fā)確診為肺結(jié)核的病人、糖尿病合并肺結(jié)核病人各20例及健康志愿者20例。研究者年齡＜50歲。HBsAg陰性，HIV抗體陰性，并簽署知情同意書的志愿者。

1.2 主要試劑 胎牛血清購自杭州四季青；Ficoll淋巴細胞分離液購自天津灝陽生物；NO檢測試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒均購于南京建成公司；改良羅氏培養(yǎng)基購于杭州創(chuàng)新生物公司；結(jié)核桿菌株由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科P2實驗室提供。

1.3 巨噬細胞的分離培養(yǎng)及成熟誘導(dǎo) 取健康組、結(jié)核病組、糖尿病合并肺結(jié)核組肝素抗凝外周全血20 mL，經(jīng)密度梯度離心法(2 500 r/min×20 min)分離單個核細胞。生理鹽水洗3次，用完全培養(yǎng)基 (10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液)調(diào)整細胞濃度為2×106/mL，加入6孔培養(yǎng)板，37℃ 5%CO2孵箱培養(yǎng)2 h。去除懸浮細胞，貼壁細胞即為單核細胞。每孔加完全培養(yǎng)基2 mL誘導(dǎo)分化成巨噬細胞，隔2 d換液，培養(yǎng)第9天收集培養(yǎng)上清液及巨噬細胞。

1.4 巨噬細胞電鏡觀察 收集巨噬細胞用多聚甲醛-戊二醛4℃固定90 min后，將細胞移入離心管中，用PBS洗滌2次，離心(3 000 r/min×5 min)后再4℃保存于PBS中。1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，電子染色，透射電鏡觀察巨噬細胞形態(tài)學(xué)超微結(jié)構(gòu)。

1.5 檢測巨噬細胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、NO水平 收集第9天巨噬細胞培養(yǎng)上清液，用ELISA試劑盒檢測TNF-α水平，用硝酸還原酶法檢測NO水平，操作步驟按說明書進行，顯色后用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準曲線確定TNF-α和NO水平。

1.6 結(jié)核桿菌的培養(yǎng)及計數(shù) 用改良羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核桿菌2周后挑取菌落研磨，麥氏比濁法測定菌液濃度，調(diào)整為1 mg/mL(相當(dāng)于菌量為3×108個/mL)。用生理鹽水稀釋后感染巨噬細胞，感染按細菌∶細胞=10∶1比例進行。

1.7 巨噬細胞殺滅結(jié)核桿菌能力檢測 收集并裂解感染結(jié)核桿菌24 h的各組巨噬細胞(方法同參考文獻[5])：先用生理鹽水洗滌3次，然后每孔加4℃保存的滅菌雙蒸水0.5 mL，室溫放置10 min，再加0.5 mL/孔細胞裂解液，觀察細胞完全裂解后，收集孔內(nèi)全部液體離心(10 000 r/min×10 min)。離心棄上清液，每管加20%BSA 0.5 mL，渦旋振蕩30 s，制成菌懸液。用生理鹽水將懸液按10×梯度逐級稀釋，去不同稀釋度的菌液0.1 mL，接種在羅氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)10 d后觀察菌落數(shù)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用柱形圖表示，多個組比較采用方差分析，兩個組比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 巨噬細胞形態(tài)學(xué)觀察 細胞培養(yǎng)第9天透射電鏡觀察顯示，巨噬細胞胞質(zhì)內(nèi)含大量特征性標(biāo)志物溶酶體，吞飲小泡、吞噬體，線粒體豐富，胞漿顆粒明顯，細胞膜內(nèi)側(cè)有許多微絲和微管(圖1～2)。

2.2 TNF-α及NO的檢測 ELISA檢測各組間TNF-α水平均有差異，其中TB+DM組(597.5±69.1)pg/mL較TB組(688.2±64.8)pg/mL、健康組(839.3±74.5)pg/mL顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.48，P＜0.05)，TB組低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05，圖3)；NO水平各組間均有差異TB+DM組(57.3±14.6)μmol/L較TB組(83.5±23.3)μmol/L、健康組(108.9±22.3)μmol/L顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.522，P＜0.05)，TB組低于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4)。

圖1 培養(yǎng)第9天巨噬細胞

圖2 巨噬細胞電鏡圖

圖3 各組巨噬細胞上清液中TNF-α水平比較

圖4 各組巨噬細胞上清液中NO水平比較

2.3 巨噬細胞內(nèi)活菌計數(shù)的比較 將接種的細菌計數(shù)取10的對數(shù)值(lg CFU)表示。感染巨噬細胞前計數(shù)接種的活菌數(shù)為6.7。裂解巨噬細胞培養(yǎng)被巨噬細胞吞噬的MTB，10 d后計數(shù)菌落，各組間均有差異。TB+DM組(6.14±0.154)較TB組(5.97±0.132)、健康組(5.77±0.127)顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.165，P＜0.05)，TB組高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

圖5 各組巨噬細胞內(nèi)活菌計數(shù)比較

3 討論

糖尿病作為結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的一個重要危險因素，已經(jīng)越來越受到關(guān)注。動物實驗研究顯示，糖尿病大鼠對結(jié)核桿菌具有高度的易感性可能與其抗結(jié)核免疫功能下降有關(guān)[4，6]。在宿主抗結(jié)核免疫中，巨噬細胞是主要效應(yīng)細胞，受結(jié)核桿菌感染后首先是巨噬細胞作出反應(yīng)，分泌大量TNF-α、IL-6、IL-1等細胞因子使淋巴細胞和單核細胞聚集到結(jié)核桿菌入侵部位，限制其擴散并殺滅結(jié)核桿菌[1，6-7]。在結(jié)核病發(fā)病機制中，結(jié)核桿菌通過多種途徑逃避免疫攻擊，但最終都是通過影響或利用巨噬細胞來躲避宿主抗結(jié)核免疫應(yīng)答的。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血單核細胞誘導(dǎo)分化的巨噬細胞分泌的TNF-α水平較單純肺結(jié)核組和健康組相比顯著降低，TNF-α主要由巨噬細胞分泌，在宿主抗結(jié)核病中起著重要的作用。它能促進淋巴細胞和單核細胞聚集到感染部位，促進宿主細胞對結(jié)核桿菌的殺滅作用。同時還能促進受感染發(fā)生的巨噬細胞凋亡，從而釋放出未被徹底殺滅的結(jié)核桿菌，使之重新受到活化后的免疫細胞的吞噬和殺滅，以防止結(jié)核桿菌慢性反復(fù)感染和復(fù)發(fā)[8]。TNF-α水平降低，表明糖尿病合并肺結(jié)核患者體內(nèi)的巨噬細胞抗結(jié)核免疫功能受損。研究還發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并肺結(jié)核患者巨噬細胞分泌的NO水平也顯著低于單純肺結(jié)核組和健康組。NO由巨噬細胞分泌產(chǎn)生，能顯著增強巨噬細胞殺滅結(jié)核桿菌的能力，并作為巨噬細胞活化的一個重要標(biāo)志。其水平降低，表明糖尿病患者巨噬細胞活化及殺滅結(jié)核桿菌能力降低[9]。這也可能是糖尿病患者易感肺結(jié)核的重要原因之一。

在活化后的3組巨噬細胞吞噬殺滅結(jié)核桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并肺結(jié)核患者的巨噬細胞吞噬結(jié)核桿菌后，其未殺滅的結(jié)核桿菌菌落數(shù)顯著高于單純肺結(jié)核組和健康組。表明糖尿病合并肺結(jié)核組巨噬細胞殺滅結(jié)核桿菌的能力降低，這可能也是糖尿病合并肺結(jié)核患者容易導(dǎo)致結(jié)核病反復(fù)感染、復(fù)發(fā)及產(chǎn)生耐多藥的重要因素之一[3]。

綜上所述，本研究通過檢測糖尿病合并肺結(jié)核患者巨噬細胞活化及吞噬能力，從細胞層面研究糖尿病易感肺結(jié)核的發(fā)病機制，為糖尿病與肺結(jié)核相關(guān)性的免疫學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

[1]王建軍，郭述良，李蘭，等.ManLAM對樹突狀細胞成熟及下游免疫的影響[J].中國免疫學(xué)雜志，2010，26(7)：587-590.

[2]Stevenson CR，Critchley JA，F(xiàn)orouhi NG，et al.Diabetes and the risk of tuberculosis:a neglected threat to public health[J].Chronic Illn，2007，3(3)：228-245.

[3]Singla R，Khan N.Does diabetes predispose to the development of multidrug-resistant tuberculosis？[J].Chest，2003，123(1)：308-309.

[4]Sugawara I，Mizuno S.Higher susceptibility of type 1 diabetic rats to Mycobacterium tuberculosis infection[J].Tohoku J Exp Med，2008，216(4)：363-370.

[5]Broxmeyer L，Sosnowska D，Miltner E，et al.Killing of Mycobacterium avium and Mycobacterium tuberculosis by a mycobacteriophage delivered by a nonvirulentmycobacterium：a model for phage therapy of intracellular bacterial pathogens[J].J Infect Dis，2002，186(8)：1155-1160.

[6]Sugawara I，Yamada H，Mizuno S.Pulmonary tuberculosis in spontaneously diabeticgoto kakizakirats[J].Tohoku JExp Med，2004，204(2)：135-145.

[7]Vallerskog T，MartensGW，KornfeldH.Diabeticmicedisplay adelayed adaptiveimmuneresponseto Mycobacterium tuberculosis[J].J Immunol，2010，184(11)：6275-6282.

[8]Loeuillet C，Martinon F，Perez C，et al.Mycobacterium tuberculosis subverts innate immunity to evade specific effectors[J].J Immunol，2006，177(9)：6245-6255.

[9]王建軍，郭述良，羅永艾.C型凝集素在結(jié)核病發(fā)病機制中的作用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2010，33(3)：214-216.