許鑫 蘇瑞 金敏婷 張舒婷 陳榮 方洪壯

（1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟(jì)寧 272000）

木賊為木賊科木賊(Equisetum hiemale L.)的干燥地上部分，現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2010年版（一部）。木賊具有“疏散風(fēng)熱、明目、退翳”等傳統(tǒng)功效和多種藥理活性，主要含有酚酸類和黃酮類多種化學(xué)成分[1-3]。現(xiàn)今，木賊的質(zhì)量控制方法，僅涉及其所含的黃酮苷或單一的黃酮苷元的含量測(cè)定[4-7]，而木賊中的酚酸類成分的含量測(cè)定尚未見(jiàn)報(bào)道。為了更全面地控制木賊藥材的質(zhì)量，本研究采用HPLC-DAD-MS/MS技術(shù)，通過(guò)木賊色譜峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)[8-10]，推斷化合物的歸屬，進(jìn)而與對(duì)照品的色譜、光譜、質(zhì)譜比對(duì)，確定了酚酸成分阿魏酸及2種黃酮苷元，蜀葵苷元與山柰素；建立了木賊中阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素3種成分含量同時(shí)測(cè)定的HPLC多波長(zhǎng)法。所建立木賊藥材中3種成分含量同時(shí)測(cè)定的方法，準(zhǔn)確可靠、靈敏度高，可供木賊質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)參考。

1 儀器和材料

Agilent 1200系列高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫儀器有限公司)，包括G1311A四元泵，G1322真空脫氣機(jī)，G1329自動(dòng)進(jìn)樣器，G1315DAD檢測(cè)器，6310離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器。木賊藥材6批，其中5批2008年購(gòu)于國(guó)內(nèi)不同城市，1批2008年秋采自于黑龍江伊春地區(qū)，經(jīng)佳木斯大學(xué)藥學(xué)院宗希明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為木賊科植物木賊（Equisetum hiemale L.）。阿魏酸、山柰素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；蜀葵苷元對(duì)照品（上海永恒生物有限公司），純度99.8%；乙腈、甲醇為色譜純，甲酸、醋酸銨、鹽酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 測(cè)定條件

2.1.1 HPLC-DAD條件ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm× 4.6 mm，5 μm)；乙腈(A)－0.2%甲酸水(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫程序：0 ～ 10 min，18%(A)；10 ～ 20 min，18% ～38%(A)；20 ～ 27 min，38%(A)。柱溫 35℃，進(jìn)樣量 20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)276、323 nm、366 nm。

2.1.2 HPLC-DAD-MS條件紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為282 nm，光譜波長(zhǎng)記錄范圍210～400 nm，波長(zhǎng)間隔2 nm。蜀葵苷元和山柰素的定性的色譜條件同“2.1.1”項(xiàng)，阿魏酸的定性時(shí)的流動(dòng)相為甲醇－0.1%醋酸銨，洗脫梯度，47 min內(nèi)甲醇由5%線性升至100%。質(zhì)譜條件為：Turbo Ion spray(ESI源)，干燥氣的體積流量10 L/min，干燥氣的溫度350℃，霧化室壓力35.0 psi，掃描范圍m/z 50～1 000 amu；負(fù)離子模式檢測(cè)，多級(jí)反應(yīng)檢測(cè)掃描方式，柱后1∶1分流。

2.2 溶液的制備

2.2.1供試品溶液參照2010版中國(guó)藥典木賊的含量測(cè)定項(xiàng)下的提取方法[5]，取過(guò)三號(hào)篩的粉末約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液20 mL，加鹽酸10 mL，置水浴中加熱水解1 h，放冷，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加75%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.2.2對(duì)照品溶液精密稱取阿魏酸、蜀葵苷元和山柰素對(duì)照品適量，以甲醇溶解制備混和對(duì)照品儲(chǔ)備液，阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素濃度分別為0.10、0.16、0.50 mg/mL。避光冷藏。測(cè)定時(shí)，按所需濃度將儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成對(duì)照品混合溶液。

2.3 定性分析

2.3.1蜀葵苷元與山柰素的定性取供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下HPLC-DAD-MS條件測(cè)定。供試液在282 nm下的色譜圖及供試液的質(zhì)譜總離子流圖見(jiàn)圖1。圖1中保留時(shí)間21.57 min化合物，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 301[M-H]－，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 283[M-H-H2O]－、m/z 273[M-CO]－、m/z 245[M-CO-H2O]－、m/z 229[M-CO-H2O-O]，與文獻(xiàn)中報(bào)道的蜀葵苷元相一致[8]，推斷為蜀葵苷元。26.15 min的化合物，準(zhǔn)分子離子峰m/z 285[M-H]－、質(zhì)譜主要碎片離子為 m/z 267[M-H-H2O]－、m/z 257[M-H-CO]－、m/z 229[M-H-CO-CO]－、m/z210.9[M-H-HCOOH]、m/z184[M-H-C4H4O3]，與文獻(xiàn)中的山柰素質(zhì)譜數(shù)據(jù)相同[8]，推斷為山柰素。取對(duì)照品混合溶液，按供試液測(cè)定條件進(jìn)行測(cè)定，經(jīng)樣品中的初判化合物與相應(yīng)對(duì)照品的保留時(shí)間、紫外光譜和質(zhì)譜的比對(duì)，最終確定上述兩個(gè)化合物分別為蜀葵苷元和山柰素。

圖1 蜀葵苷元與山柰素定性時(shí)的木賊色譜圖(A)與總離子流圖(B)

2.3.2阿魏酸的定性按“2.2.1”項(xiàng)下的條件測(cè)定供試品溶液。供試液在282 nm下的色譜圖與供試液的質(zhì)譜總離子流圖見(jiàn)圖2。圖2中保留時(shí)間9.94 min化合物，準(zhǔn)分子離子峰為m/z 193[M-H]－，二級(jí)質(zhì)譜主要碎片離子為m/z 177.9[M-H-OCH3]－、m/z 133.9[M-H-OCH3-COO]－，與文獻(xiàn)中報(bào)道的阿魏酸一致[10]，初步將該化合物判為阿魏酸。另取對(duì)照品混合溶液，按上述條件測(cè)定，通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間、紫外光譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的比較，確定該化合物為阿魏酸。

2.4 定量分析

2.4.1色譜系統(tǒng)適用性根據(jù)HPLC-DAD的紫外光譜圖，選定阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的最大吸收波長(zhǎng)323、276、366 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，供試液在上述波長(zhǎng)下的色譜圖見(jiàn)圖3。3種物質(zhì)的理論板數(shù)分別為13 002、115 936、121 641，分離度分別大于3.6、3.5、3.4。另取適當(dāng)濃度的對(duì)照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，及5 d分別進(jìn)樣，考察阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的重復(fù)性，各峰相對(duì)保留時(shí)間及峰面積的日內(nèi)和日間RSD值見(jiàn)表1。由所測(cè)數(shù)據(jù)可知，色譜系統(tǒng)的各項(xiàng)指標(biāo)均滿足于定量要求。

圖2 阿魏酸定性時(shí)的木賊色譜圖(A)與總離子流圖(B)

圖3 供試品定量波長(zhǎng)下的色譜圖

表1 阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的相對(duì)保留時(shí)間與峰面積重復(fù)性

2.4.2線性關(guān)系精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別置 100 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，按設(shè)定的色譜條件測(cè)定峰面積。以阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素質(zhì)量X對(duì)色譜峰面積Y計(jì)算回歸方程。阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素分別在 0.02 ～ 0.2 μg、0.032 ～ 0.32 μg、0.1～1 μg范圍內(nèi)與各自的峰面積的線性關(guān)系良好，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4.3檢測(cè)限和定量限以甲醇逐級(jí)稀釋混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，在選定色譜條件下測(cè)定。取信噪比S/N=3時(shí)的質(zhì)量為最低檢測(cè)限，S/N=10時(shí)的質(zhì)量為最低定量限。阿魏酸、蜀葵苷元和山柰素的最低檢測(cè)限和最低定量限見(jiàn)表2。

2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取供試品溶液，室溫下放置，按上述色譜條件分別每間隔1 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，化合物阿魏酸、蜀葵苷元的峰面積值在4 h后開(kāi)始減少，3種物質(zhì)在4 h內(nèi)峰面積的RSD分別為 1.40%，0.30%，0.10%。供試品溶液室溫條件下，4 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5回收率試驗(yàn)分別取已知含量的同一產(chǎn)地樣品6份，各約0.75 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，每份樣品加入4.5 mL混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，水浴蒸干甲醇，精密稱定。按“2.2.1”項(xiàng)下自“精密加入 75%甲醇 50 mL”起操作，制備供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算加樣回收率。阿魏酸、蜀葵苷元、山柰素的平均回收率分別為100.1%、99.4%、99.7%，RSD分別為0.89%、1.5%、1.3%。

表2 木賊藥材中3種成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限與定量限

2.4.6樣品的測(cè)定按供試品溶液制備方法及定量色譜條件，測(cè)定不同來(lái)源的6批木賊藥材中的3種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 以乙腈-0.2%甲酸水溶液為色譜流動(dòng)相質(zhì)譜定性時(shí)，未檢測(cè)到阿魏酸?？赡茉诖藯l件下，阿魏酸未能離子化，得不到其母離子及其相關(guān)的碎片離子。因此，將甲酸改換為醋酸銨以促進(jìn)阿魏酸的離子化。又因以乙腈－醋酸銨水溶液為流動(dòng)相時(shí)，阿魏酸與溶劑同時(shí)出峰，故采用甲醇－0.1%醋酸銨水溶液為流動(dòng)相。

表3 6批木賊藥材3種成分的百分含量

3.2 定量分析時(shí)，為增強(qiáng)測(cè)定的靈敏性和選擇性，采用了多個(gè)波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定的方法，測(cè)定波長(zhǎng)分別選在阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素的紫外最大吸收處的波長(zhǎng)。

3.3 所測(cè)定的3種活性成分均為供試品溶液色譜中信號(hào)較強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)。木賊藥材中，經(jīng)HPLC-DAD-MS/MS定性分析雖有槲皮素等黃酮的存在，但色譜信號(hào)強(qiáng)度較阿魏酸、蜀葵苷元及山柰素低的多，難以與這3種活性成分同時(shí)定量。

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