姚 娟，馬慧萍，楊 燕，樊鵬程，景臨林，賈正平

(1.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000;2.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院藥材科，甘肅蘭州 730050)

維持氧穩(wěn)態(tài)是保證哺乳動物細(xì)胞正常生長與分化的必需條件［1］，缺氧可嚴(yán)重影響機體的正常生理功能，在缺氧環(huán)境下，機體出現(xiàn)肺水腫、缺氧性肺動脈高壓［2］、氧自由基代謝紊亂、細(xì)胞鈣離子超載、興奮性氨基酸中毒、線粒體膜通透性改變等，但細(xì)胞缺氧損傷精確的機制尚未闡明。本實驗利用PC12細(xì)胞建立培養(yǎng)細(xì)胞缺氧模型，通過觀察缺氧前后細(xì)胞的形態(tài)、檢測不同缺氧時間點LDH活性、HIF-1 mRNA表達水平差異，探討了缺氧對PC12細(xì)胞的損傷作用及其初步機制，為缺氧損傷性疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料

PC12細(xì)胞由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院惠贈;OLM-PUS TH4-200倒置顯微鏡(日本OLMPUS公司);DMEM/F-12培養(yǎng)基(CIBCO公司);胎牛血清(蘭州民海生物工程有限公司);Thermo三氣培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);甲基噻唑藍四氮唑鹽(MTT，Invitrogen公司);二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司);Model 550型酶標(biāo)儀(美國Bio-RAD);XK96-3型微量振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司);RNAiso Reagent、TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit、PCR 擴增試劑盒(大連寶生物公司);引物由寶生物工程公司合成。

2 方法

2.1PC12細(xì)胞的培養(yǎng)PC12細(xì)胞接種培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液中(含有青霉素1×105IU·L-1及鏈霉素1×105IU·L-1)，培養(yǎng)在37℃、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱，每3天換液1次。大約在培養(yǎng)PC12細(xì)胞鋪滿皿底約70% ～80%后傳代。

2.2PC12細(xì)胞形態(tài)觀察在倒置顯微鏡下觀察正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞及缺氧48 h的形態(tài)變化。

2.3MTT法檢測缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞的增殖影響將細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，調(diào)整細(xì)胞密度至 5 ×103·L-1，每孔 200 μl，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分正常組和缺氧組，正常組細(xì)胞37℃、5%CO2、飽和濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 0，12，24，48 h，缺氧組細(xì)胞 37℃、95%N2+5%CO2、飽和濕度缺氧處理 0，12，24，48 h。棄培養(yǎng)液，PBS漂洗1次，每孔加入20 μl MTT(終濃度為0.5 g·L-1)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，加入 DMSO 150 μl，振蕩10 min，紫色結(jié)晶完全溶解后，于全自動酶標(biāo)儀490 nm波長處測定OD值。以正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞作為對照，計算缺氧處理0，12，24，48 h 的抑制率，抑制率 CI/%=(1-試驗組OD值/對照組OD值)×100%。抑制率為正值表示對細(xì)胞有殺傷作用，負(fù)值表示對細(xì)胞有促增殖作用。

2.4缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞LDH的影響乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，5-二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕紅色，通過比色可求出酶活力。PC12 細(xì)胞缺氧培養(yǎng) 0，2，4，8，12，24 和48 h后測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液乳酸脫氫酶的活力，以0 h作為對照組，按LDH測試盒說明操作并計算LDH活力。

2.5缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞HIF-1 mRNA表達水平的影響提取總RNA:PC12細(xì)胞缺氧處理0，2，4，8，12，24，48 h 后，棄培養(yǎng)液，PBS 漂洗2 次，加入1 ml RNAiso Reagent試劑裂解細(xì)胞，收集裂解液加入200 μl氯仿 4℃ 13 500 r·min-1離心 15 min，取上清液加入等體積的異丙醇混勻后冰上靜置15 min，4℃ 13 500 r·min-1離心15 min棄上清液，75%乙醇純化沉淀，4℃ 13 500 r·min-1離心5 min，棄上清后-80℃保存，紫外分光光度計檢測濃度，并用1%甲醛變性瓊脂糖電泳檢測其完整性。

逆轉(zhuǎn)錄:使用TakaRa Prime ScriptTMreagent Kit將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件均參照說明書設(shè)定。

引物設(shè)計:在Genbank中查詢HIF-1α、GAPDH mRNA序列，由寶生物公司根據(jù)序列設(shè)計并合成引物。GAPDH作為參照(Tab 1)。

Real-time PCR檢測:按照Applied Biosystems公司7300儀器操作說明進行實驗。采用20 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件:兩步法PCR擴增，條件為95℃預(yù)變性30 s;95℃反應(yīng)5 s，60℃退火 31 s，40個循環(huán)。Real-time RT-PCR實驗數(shù)據(jù)以0 h作為對照，采用△△Ct法處理數(shù)據(jù)［3］。

2.6統(tǒng)計學(xué)方法所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件完成，結(jié)果均以±s表示。各組的組間均數(shù)比較用方差分析。

3 結(jié)果

3.1PC12細(xì)胞形態(tài)觀察正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，呈不規(guī)則圓形，折光度強，成簇生長，F(xiàn)ig 1A。缺氧損傷48 h后，細(xì)胞變圓，折光度減弱，最終細(xì)胞圓縮，脫落，F(xiàn)ig 1B。

3.2MTT法檢測缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞的增殖作用不同缺氧作用時間對PC12細(xì)胞有一定影響，存在時效關(guān)系。分別于0，12，24，48 h用MTT法測定其對細(xì)胞的增殖作用，缺氧12 h與對照組比較細(xì)胞活力降低(P＜0.05)，缺氧24 h與對照組比較細(xì)胞活力降低(P＜0.01)，結(jié)果見 Fig 2，Tab 1。

Fig 1 Morphology changes on PC 12 cell after hypoxia(×200)

Fig 2 Optical density(OD)of hypoxia on PC12 cells by MTT colorimetry(±s，n=6)

結(jié)果表明，缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，0，12，24，48 h 4 個不同時間點，隨著時間的增加，缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞的增殖抑制作用明顯增強。

3.3缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞中LDH的影響乳酸脫氫酶法測定缺氧不同時間對PC12細(xì)胞損傷程度，結(jié)果見Fig 3。

Fig 3 Influence of LDH on PC12 cells by hypoxia environment(ˉx ± s，n=6)

Tab 2 Cytotoxic index(CI)of hypoxia on PC12 cells by MTT colorimetry

結(jié)果表明，缺氧2，4，8，12 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH活性增高，到8 h達到頂峰，與對照組相比具有差異(P＜0.01)。缺氧24 h后LDH酶的活力下降，說明缺氧環(huán)境能引起LDH釋放，并有一定的時效關(guān)系。

3.4缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞HIF-1 mRNA表達量的影響采用Real-time RT-PCR檢測缺氧環(huán)境對PC12細(xì)胞HIF-1 mRNA表達量的影響，不同缺氧作用時間對PC12細(xì)胞HIF-1 mRNA的表達量有一定影響，存在時效關(guān)系。分別在2，4，8，12 h提高HIF-1 mRNA的表達量，與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)，缺氧4 h時HIF-1 mRNA的表達量最高。在缺氧24，48 h HIF-1 mRNA的表達量下降，結(jié)果見Fig 4。觀察GAPDH和HIF-1 mRNA的溶解曲線和擴增曲線，表明二者的Real-time RT-PCR擴增為特異性擴增，見 Fig 5，6。

Fig 4 The effect of hypoxia on PC12 cell of the HIF-1 mRNA expression(±s，n=3)

4 討論

PC12細(xì)胞(pheochromocyte cell)為大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞克隆化細(xì)胞株，具有神經(jīng)細(xì)胞的特性，當(dāng)細(xì)胞因缺氧受到損傷時，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈?zhǔn)軗p，電子傳遞阻斷，ATP產(chǎn)生減少。琥珀酸脫氫酶是呼吸鏈里的重要復(fù)合酶之一，測定其的活性可以反映PC12細(xì)胞缺氧損傷的程度。MTT比色法原理是活細(xì)胞內(nèi)的琥珀酸脫氫酶可以將MTT(一種淡黃色的四甲基偶氮唑鹽)還原成藍紫色甲臜，此物質(zhì)的光吸收值與細(xì)胞活性成正比關(guān)系［4］。乳酸脫氫酶存在于所有動物的組織中，缺氧導(dǎo)致PC12細(xì)胞膜損傷時，細(xì)胞內(nèi)乳酸脫氫酶外漏，導(dǎo)致培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶的活性升高，測定乳酸脫氫酶活性是檢測細(xì)胞膜損傷程度的一個靈敏指標(biāo)。結(jié)果表明:PC12細(xì)胞缺氧后核固縮，折光度減弱，最終細(xì)胞脫落。采用MTT法考察表明缺氧環(huán)境能夠抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞缺氧損傷后細(xì)胞活力降低，48 h時增殖抑制極明顯。缺氧2，4，8，12 h后細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶的活性明顯增加，缺氧24 h后可能由于大量細(xì)胞凋亡和死亡的發(fā)生，乳酸脫氫酶活性明顯降低。

Fig 5 The Dissocation plot of GAPDH and HIF-1 mRNA

Fig 6 The Amplification plot of GAPDH and HIF-1 mRNA

嚴(yán)重或持續(xù)缺氧時，缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HIF-1α為缺氧應(yīng)答的全局性調(diào)控因子，在缺氧誘導(dǎo)的哺乳動物細(xì)胞中廣泛表達，對缺氧具有特異感受性，參與體內(nèi)許多缺氧反應(yīng)性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［5］。pHVL蛋白是E3泛素連接酶的一個組分，pHVL蛋白也是HIF-1α蛋白降解的一個靶點，在常氧環(huán)境下，HIF-1α結(jié)合pHVL蛋白，使HIF-1α在常氧細(xì)胞中低表達［6］。在缺氧環(huán)境能夠抑制HIF-1α和pHVL蛋白的結(jié)合，HIF-1α的表達水平較高［7］。本實驗的結(jié)果也表明缺氧2，4，8，12 h后 HIF-1 mRNA 的表達水平與對照組相比明顯增高，提供了缺氧時間與HIF-1 mRNA的表達水平的時效關(guān)系。

現(xiàn)有研究表明缺氧損傷主要影響細(xì)胞膜電位、介質(zhì)的合成、ATP合成、細(xì)胞酸堿代謝、細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度、溶酶體的釋放等［8］。目前抗缺氧損傷的研究主要集中于機體的整體水平方面，具有良好抗缺氧作用的藥物不斷被學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，如:茵陳素［9］、丹參酮-ⅡA磺酸鈉［10］等，但細(xì)胞分子水平上的研究還不夠深入，闡明缺氧的損傷機制和抗缺氧藥物的作用靶點需從分子水平進行研究。本研究為進一步探討缺氧的細(xì)胞和分子機制提供了一定的理論依據(jù)，相信隨著缺氧損傷相關(guān)研究的進展，將有助于闡明缺氧的詳明機制，最終將為研制出抗缺氧療效好、毒副作用小的抗缺氧新藥提供更多的機制依據(jù)。

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