馬 騰，劉嘯白，薛一雪

(中國醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室、2.第96期臨床醫(yī)學(xué)7年制，遼寧沈陽 110001)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性腦腫瘤患者的術(shù)后化療是目前治療腫瘤的主要手段［1］。由于正常腦組織存在血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)，而腫瘤組織也存在著血腫瘤屏障(blood-tumor barrier，BTB)，從而限制了抗腫瘤藥物進(jìn)入腫瘤組織。因此有效地增加腫瘤組織中抗腫瘤藥物的濃度，是提高化療藥物療效的關(guān)鍵［2］。本實(shí)驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)緩激肽(bradykinin，BK)能夠選擇性開放BTB［3］，BK開放BTB過程中出現(xiàn)PKA下調(diào)，細(xì)胞骨架重排，神經(jīng)型一氧化氮合酶升高，Akt磷酸化增加［4］等，但BK的作用是通過何種信號(hào)通路發(fā)揮作用以及分子機(jī)制如何，尚未見報(bào)道。

RhoA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的小G蛋白，參與許多血管活性物質(zhì)介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞通透性升高的過程［5］。BK是通過與其2型受體(B2)作用開放BTB。B2受體屬于G蛋白偶聯(lián)性受體，BK、溶血磷脂酸和凝血酶都是G蛋白偶聯(lián)受體激動(dòng)劑，可以使COS-7和成纖維細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)性受體激活，進(jìn)而通過RhoA信號(hào)通路介導(dǎo)絲狀肌動(dòng)蛋白(filamentous actin，F(xiàn)-actin)細(xì)胞骨架重排，引起緊密連接相關(guān)蛋白o(hù)ccludin、claudin-5和ZO-1重分布，緊密連接(tight junction，TJ)開放［6］。上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是否參與BK開放BTB調(diào)節(jié)過程目前尚不清楚。

本研究的目的是明確BK與B2受體結(jié)合后是否通過RhoA介導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布，進(jìn)而開放BTB。

1 材料與方法

1.1NU血清(BD Biosciences);FBS(杭州四季青公司);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco公司);claudin-5抗體(Santa Cruz);phalloidin-TRITC熒光抗體，RhoA特異性抑制劑肉毒梭菌C3胞外酶(C3exoenzyme)，緩激肽，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(Sigma)。

1.2腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和體外BTB模型的制作小于1周的胎大鼠用CO2吸入法處死，開顱取全腦，去除腦膜。分離培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Rat brain microvascular endothelail cell，RBMECs)的方法如文獻(xiàn)［7］。對(duì)于所有的實(shí)驗(yàn)，只選用第一、二代細(xì)胞，細(xì)胞在37℃的濕潤環(huán)境(5%CO2和95%的空氣)中培養(yǎng)。按照Liu等［7］的方法建立體外BTB模型。

1.3實(shí)驗(yàn)分組與BK及抑制劑的處理由于本實(shí)驗(yàn)室前期工作已表明BK 15 min組，BTB的通透性達(dá)到峰值，以后逐漸恢復(fù)。所以本實(shí)驗(yàn)共分為5組(每組8例)，對(duì)照組(沒有C6細(xì)胞共培養(yǎng)的RBMECs細(xì)胞單層)、BK 0 min組、BK 5 min組、BK 10 min組和BK 15 min組(BK處理的各組均采用的是體外BTB模型的細(xì)胞單層)。在對(duì)照組中加入等量的無菌生理鹽水(1 μmol·L-1)處理15 min。(在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，生理鹽水處理 0、5、10、15 min 后，BTB 的通透性沒有明顯的差別，P＞0.05)。將RhoA特異性抑制劑C3exoenzyme(50 mg·L-1)加到Transwell小室的上室培養(yǎng)基中，作用4 h后移去上室的所有培養(yǎng)基，向上室加入 BK(1 μmol·L-1)。

1.4跨內(nèi)皮阻抗值(TEER)的測(cè)量TEER是應(yīng)用微孔電阻系統(tǒng)在37℃恒溫下檢測(cè)的，最終的TEER值與Transwell小室的表面積相乘計(jì)算，用Ω·cm2表示。

1.5辣根過氧化物酶(HRP)流量測(cè)定將Transwell中與C6細(xì)胞共培養(yǎng)的和單獨(dú)培養(yǎng)的RBMECs細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的24孔板中。將含有0.5 HRP μmol·L-1的無血清DMEM培養(yǎng)基加入Transwell小室的上室中。在經(jīng)過BK作用后的特定時(shí)間點(diǎn)上，收集下室的培養(yǎng)基并通過色度法測(cè)量樣品中的HRP含量。HRP流量用通過每平方厘米表面積的皮摩爾數(shù)表示。

1.6Western blot檢測(cè)claudin-5的表達(dá)和分布當(dāng)Transwell小室的上室的細(xì)胞生長到融合時(shí)，用含有0.1 mmol·L-1EDTA(不含有鈣鎂離子)的PBS沖洗，用細(xì)胞鏟小心刮取下來，倒入1 ml裂解液 A(2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1EGTA，0.1 mmol·L-1NaF，20 mmol·L-1Tris-HCl，protease inhibitor cocktail，PMSF，24 mmol·L-1Triton X-100 ，pH 7.5)，4℃勻漿，離心，收集上清(含可溶性片段)。在沉淀中加入150 μl裂解液B(裂解液 A加40 μmol·L-1SDS)，超聲波勻漿，離心，收集上清(含不可溶性片段)。取40～50 μg總蛋白經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜。抗Claudin-5抗體(1∶300;Santa Cruz)，抗 β-actin抗體(1∶800;Santa Cruz)4℃孵育過夜，在羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗(購自北京中山生物技術(shù)公司)中室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光、X線曝光、顯影，所得膠片用Chemi Imager 5500 V2.0軟件掃描，通過 Fluor Chen 2.0軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)得光密度值(integrated density value，IDV)。

1.7免疫熒光法和細(xì)胞熒光標(biāo)記法觀察claudin-5和F-actin表達(dá)和分布將生長在蓋玻片上RBMECs單層用4%的多聚甲醛固定，12 mmol·L-1TritonX-100 透化，0.75 μmol·L-1BSA 封閉。采用間接免疫熒光法檢測(cè)claudin-5，一抗為claudin-5抗體(1∶150;Santa Cruz)，陰性對(duì)照用0.01 mol·L-1PBS代替一抗，應(yīng)用FITC標(biāo)記的熒光二抗(1∶150)，避光條件下染色，甘油封片，熒光顯微鏡觀察，采集圖像。細(xì)胞骨架蛋白F-actin的檢測(cè)采用細(xì)胞熒光標(biāo)記法，細(xì)胞與phalloidin-TRITC(1∶200;Sigma)孵育2 h，熒光顯微鏡觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間采用t檢驗(yàn)，多組間采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

Fig 2 Effect of C3exoenzyme on changes in HRP flux of BTB

2.1C3exoenzyme抑制BK介導(dǎo)BTB通透性的增加如Fig 1所示，BK作用5 min后TEER值開始降低，最低值出現(xiàn)在BK作用15 min時(shí)，BK 15 min組TEER值低于Control組和BK 0 min組，但BK 15 min+C3exoenzyme組TEER值較BK 15 min升高。如Fig 2所示，BK以時(shí)間依賴性方式增加HRP流量，BK 15 min組HRP流量高于Control組和BK 0 min組，但BK 15 min+C3exoenzyme組 HRP流量較BK 15 min組HRP流量值降低。

2.2C3exoenzyme抑制BK介導(dǎo)RBMECs跨膜蛋白claudin-5可溶性片段與不溶性片段比值增高如Fig 3所示，從BK作用5 min開始，claudin-5可溶性(S)片段和不溶性片段(IS)IDV比值升高，BK 15 min組claudin-5可溶性(S)片段和不溶性片段(IS)IDV比值高于 Control組和 BK 0 min組，C3exoenzyme預(yù)處理后，BK 15 min+C3exoenzyme組可溶性片段(S)與不溶性片段(IS)IDV比值較BK 15 min降低。

Fig 3 The IDV ratio of soluble fraction(S)and insoluble fraction(IS)of claudin-5 was detected by western blot

2.3C3exoenzyme抑制BK介導(dǎo)RBMECs緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5的重分布及細(xì)胞骨架F-actin的重排免疫熒光分析顯示，在未處理的細(xì)胞中，claudin-5位于內(nèi)皮細(xì)胞膜上，且呈連續(xù)分布，claudin-5在細(xì)胞核中有表達(dá)(Fig 4a)。BK處理后，claudin-5由連續(xù)分布狀態(tài)變?yōu)椴贿B續(xù)分布，claudin-5在細(xì)胞膜表達(dá)水平的下降，由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移(Fig 4b)。C3exoenzyme預(yù)處理后，claudin-5部分恢復(fù)連續(xù)分布狀態(tài)，claudin-5由細(xì)胞膜向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移明顯減少(Fig 4c)。

BK作用前，F(xiàn)-actin呈環(huán)狀連續(xù)地分布于RBMECs的邊緣，未見應(yīng)力纖維(Fig 4d)。BK作用后，分布于細(xì)胞邊緣的F-actin減少，應(yīng)力纖維形成增加，且分布在細(xì)胞中央?yún)^(qū) (Fig 4e)。C3exoenzyme預(yù)處理后，分布于細(xì)胞邊緣的F-actin明顯增加，應(yīng)力纖維形成明顯減少(Fig 4f)。

Fig 4 Immunofluoresence localization of claudin-5 and F-actin in RBMECs of BTB after BK infusion

3 討論

HRP是一種示蹤劑，通過透過BTB的HRP流量可檢測(cè)體外BTB通透性的變化;跨內(nèi)皮細(xì)胞阻抗實(shí)驗(yàn)也是一種檢測(cè)體外BTB通透性的實(shí)驗(yàn)。HRP流量實(shí)驗(yàn)和跨內(nèi)皮細(xì)胞阻抗實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，BK作用后TEER值明顯降低，HRP流量明顯增加，與Easton和Abbott報(bào)道的研究結(jié)果相一致［8］。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)應(yīng)用RhoA特異性抑制劑C3exoenzyme預(yù)處理后，BTB的通透性升高，證明RhoA信號(hào)通路參與BK介導(dǎo)的BTB通透性增加的過程。

緊密連接(tight junction，TJ)是維持血腦屏障完整性重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。claudin-5是構(gòu)成緊密連接的主要跨膜蛋白，是維持緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能重要組成部分［9］。當(dāng)claudin-5蛋白的可溶性片段(S)與不溶性片段(IS)IDV比值升高時(shí)，說明緊密連接結(jié)構(gòu)變化，通透性增加。本實(shí)驗(yàn)通過TritonX-100抽提技術(shù)結(jié)合Western blot分析同樣證實(shí)了BK作用下claudin-5的可溶性片段(S)與不溶性片段(IS)IDV比值明顯升高，說明BK作用下，緊密連接結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，進(jìn)而導(dǎo)致通透性增加［10］。此結(jié)果與Nighot和Tenenbaum研究一致［11-12］。本研究還發(fā)現(xiàn) C3exoenzyme預(yù)處理后，抑制了claudin-5的可溶性片段(S)與不溶性片段(IS)IDV比值升高，提示RhoA信號(hào)通路參與BK介導(dǎo)的TJ開放。

為了進(jìn)一步明確RhoA信號(hào)通路與細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布，BTB通透性增高的關(guān)系，細(xì)胞用C3exoenzyme預(yù)處理后，采用免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布的變化，明確RhoA信號(hào)通路與細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)BK作用后，claudin-5重分布，同時(shí)伴有大量應(yīng)力纖維形成?？赡軕?yīng)力纖維收縮，牽拉ZO-1蛋白，使細(xì)胞膜上跨膜蛋白claudin-5重分布，緊密連接結(jié)構(gòu)變化，使BTB通透性升高。Birukova和Breslin的研究也表明［13］RhoA具有激發(fā)應(yīng)力纖維形成，引起內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高的作用。C3exoenzyme抑制了claudin-5的重分布、F-actin的重排和應(yīng)力纖維的形成。說明RhoA信號(hào)通路參與BK介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白重分布，BTB通透性增高的過程。

上述結(jié)果證明，RhoA信號(hào)分子對(duì)BK介導(dǎo)的細(xì)胞骨架重排，緊密連接相關(guān)蛋白claudin-5重分布和表達(dá)水平的變化起到了重要的調(diào)節(jié)作用。

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