李亞清，嚴(yán)建平，許武林，王 宏

(浙江省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，浙江杭州 310014)

Toll樣受體 4(toll-like receptor 4，TLR-4)是先天性防御機(jī)制對(duì)抗感染的關(guān)鍵成分，在呼吸系統(tǒng)防御病原體及有害顆粒損傷中起著中心性保護(hù)作用［1］。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)之一。目前在哺乳動(dòng)物體內(nèi)鑒定出的MAPK亞家族包括C-Jun N末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶(JNKs/SAPKs)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERKs)、ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶 1(BMK1)及 p38 MAPK等，其中p38信號(hào)途徑是MAPK家族的重要組成部分［2］。但p38 MAPK信號(hào)通路在氣道上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8中的作用仍存在爭(zhēng)議［3-4］。因此，本研究通過(guò)LPS刺激正常人氣道上皮細(xì)胞系HBE4-E6/E7，以 TLR4抑制劑 TAK-242、p38 MAPK抑制劑SB202190、NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)預(yù)處理細(xì)胞，探討TLR4、p38 MAPK、NF-κB在氣道上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)中的作用。

1 材料與方法

1.1主要材料正常人氣道上皮細(xì)胞系HBE4-E6/E7購(gòu)自美國(guó)ATCC公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Giboc公司。TRIzol試劑購(gòu)自上海華舜公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天為時(shí)代公司。LPS(來(lái)源于E.coli0111:B4)、NF-κB 抑制劑PDTC 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。TLR4抑制劑TAK-242購(gòu)自日本TaKeDa制藥有限公司，p38 MAPK抑制劑SB202190購(gòu)自德國(guó)Merck Calbiochem公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司;人IL-8 ELISA試劑盒購(gòu)自德國(guó)R＆D Systems。NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提出試劑盒及LightShiftTM Chemiluminescent EMSA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組HBE4-E6/E7細(xì)胞復(fù)蘇后用含10%胎牛血清、105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素DMEM/F12培養(yǎng)液混懸細(xì)胞，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2.5 h，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×109·L-1，進(jìn)一步培養(yǎng)。量效實(shí)驗(yàn):將HBE4-E6/E7細(xì)胞分成5 組，分別加入終濃度為0、0.1、1、10、100 μg·L-1LPS，在 37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h。時(shí)效實(shí)驗(yàn):將HBE4-E6/E7細(xì)胞分成5組，第1組未用LPS刺激，第2～5組加入終濃度為10 μg·L-1LPS，在 37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng) 8、12、16、24 h。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn):將 HBE4-E6/E7分成5組，第3、4、5 組分別加入 100 μg·L-1TAK-242、50 mg·L-1PDTC、10 mg·L-1SB202190 預(yù)處理 30 min，接著第2、3、4、5 組分別加入終濃度為100 μg·L-1LPS刺激24h，第1組未用LPS刺激。收集細(xì)胞及上清液，-80℃保存。

1.3逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)以TRIzol提出總RNA。按MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說(shuō)明合成cDNA。按Taq酶說(shuō)明合成目的基因。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)拍照、圖像灰度分析，將目的基因擴(kuò)增片段灰密度值與內(nèi)參照β-actin擴(kuò)增片段灰密度值的比值作為目的基因mRNA表達(dá)的定量指標(biāo)。引物由北京奧科生物科技公司合成:IL-8(Genebank:NM_000584)上游 5'-GTCTGCTAGCCAGGATCCAC-3'，下 游 5'-ACACAGCTGGCAATGACAAG-3'， 產(chǎn) 物498bp。β-actin 上 游 5'-GGCACCACACCTTCTACAATGA-3'，下 游 5'-TCAGGAGGAGCAGCAATGATCTTG-3'，產(chǎn)物 745bp。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)收集細(xì)胞上清液，2 000 r·min-1離心 5 min，棄沉淀，以 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞上清液中的IL-8濃度。根據(jù)IL-8 ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5凝膠阻滯分析實(shí)驗(yàn)(EMSA)用NE-PER細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)提出試劑盒提出細(xì)胞核蛋白，按試劑盒說(shuō)明操作。由北京奧科生物科技公司設(shè)計(jì)、合成NF-κB雙鏈寡核甘酸探針。生物素標(biāo)記NF-κB探針序列，x代表生物素:5'-xGCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'(a)，5'-xAGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'(b)。未用生物素標(biāo)記NF-κB探針序列:5'-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACT-3'(a)，5'-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3'(b)。以LightShiftTMChemiluminescent EMSA試劑盒檢測(cè)NF-κB活性，步驟如下:制備5%非變性聚丙烯酰胺凝膠，100 V 預(yù)電泳 30 min，室溫孵育含 50 μg·L-1Poly(dI·dC)、0.05%NP-40、50 mmol·L-1KCl、5 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1EDTA 的結(jié)合反應(yīng)體系20 min 后，加入5 μl的5 × loading buffer，混勻，上樣，100 V電泳，380 mA電轉(zhuǎn)移1 h。將膜置于干燥的紙上(有溴酚蘭面朝上)1 min，紫外交聯(lián)10 min。以ECL方法顯影，用UVP-GDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)掃描、分析條帶灰密度值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)和單因素方差分析(組間差異用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較用q檢驗(yàn))。

2 結(jié)果

2.1LPS對(duì)HBE4-E6/E7細(xì)胞IL-8 mRNA表達(dá)的影響未用LPS刺激時(shí)，HBE4-E6/E7細(xì)胞的IL-8 mRNA表達(dá)水平較低;當(dāng)以LPS刺激后，HBE4-E6/E7細(xì)胞中IL-8 mRNA的表達(dá)隨著LPS刺激劑量的增加明顯增加(P＜0.05，F(xiàn)ig 1);在24 h內(nèi)，以10 μg·L-1LPS刺激各組細(xì)胞，IL-8 mRNA的表達(dá)隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)明顯增加(P＜0.05，F(xiàn)ig 1)。

2.2TAK-242、SB202190和PDTC對(duì)LPS誘導(dǎo)的IL-8 mRNA和蛋白表達(dá)的影響以100 μg·L-1LPS刺激HBE4-E6/E7細(xì)胞后，IL-8 mRNA和蛋白表達(dá)水平均較刺激前明顯增加(P＜0.05，F(xiàn)ig 2、3)。TAK-242、SB202190和PDTC均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HBE4-E6/E7細(xì)胞IL-8 mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0.05，F(xiàn)ig 2、3)。

2.3TAK-242、SB202190和PDTC對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB活性的影響以 100 μg·L-1LPS刺激HBE4-E6/E7細(xì)胞后，NF-κB的活性明顯增加(P＜0.05，F(xiàn)ig 4)。以100 μg·L-1TAK-242、10 mg·L-1SB202190、50 mg·L-1PDTC 和 HBE4-E6/E7預(yù)先共孵育30 min，再以100 μg·L-1LPS 刺激，結(jié)果表明TAK-242和PDTC均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HBE4-E6/E7細(xì)胞 NF-κB 的活性(P＜0.05，F(xiàn)ig 4)，而SB202190不能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活性(P＞0.05，F(xiàn)ig 4)。

Fig 1 Expression of IL-8 mRNA induced by lipopolysaccharide in HBE4-E6/E7 cells(n=8)

3 討論

LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的重要成分，能激活淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)多種細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、酶的生成與釋放，是先天性免疫系統(tǒng)強(qiáng)大的刺激因子［5］。氣道上皮細(xì)胞構(gòu)成防御病毒、細(xì)菌、香煙煙霧等因子損傷氣道的天然屏障。本研究表明:HBE4-E6/E7細(xì)胞隨著LPS刺激劑量增加或時(shí)間的延長(zhǎng)，其IL-8的表達(dá)水平明顯增加。而氣道局部炎癥或免疫刺激信號(hào)可進(jìn)一步影響氣道上皮細(xì)胞的功能，促進(jìn)氣道炎癥的發(fā)展［6］。

多種信號(hào)分子參與LPS激活效應(yīng)細(xì)胞的過(guò)程。在TLR-4介導(dǎo)的依賴分子髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor，MyD88)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，LPS在LPS結(jié)合蛋白和膜CD14的幫助下與MD-2(myeloid differentiation protein 2)結(jié)合，誘導(dǎo)TLR4/MD-2異二聚化，使MyD88和MyD88轉(zhuǎn)接蛋白類似物聚集到TLR4受體復(fù)合體。IL-1受體相關(guān)激酶(IL-1R associated kinases，IRAK)1和IRAK 4與該受體復(fù)合物結(jié)合后，IRAK 1發(fā)生磷酸化、解離，接著腫瘤壞死因受體相關(guān)因子(tumor necrosis factor receptor associate factor，TRAF)6活化。TRAF6可通過(guò)以下兩條途徑進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo):一條是包括Rel家族轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的途徑;另一條是包括p38和JNK途徑，激活轉(zhuǎn)錄激活因子2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子等轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控靶基因的表達(dá)［7-8］。TAK-242是TLR4選擇性的抑制劑［9］。本研究表明:TAK-242能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HBE4-E6/E7細(xì)胞IL-8的表達(dá)、降低LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活性。這表明TLR4在LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-8表達(dá)的信號(hào)通路上游起著的關(guān)鍵性作用。p38 MAPK在細(xì)胞核內(nèi)通過(guò)磷酸化作用能激活多種轉(zhuǎn)錄因子［2］，但其在氣道上皮細(xì)胞表達(dá)IL-8中的作用報(bào)道不一［3-4，10］。PDTC可通過(guò)抑制IκBα的降解抑制NF-κB的活性，是NF-κB活化的特異性抑制劑［11］。SB202190是 p38 MAPK特異性的抑制劑［12］。本研究表明:PDTC和SB202190均能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的HBE4-E6/E7細(xì)胞IL-8的表達(dá)，但是PDTC能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活性，而SB202190不能抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB的活性。這表明SB202190抑制LPS誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-8的表達(dá)是不依賴NF-κB信號(hào)通路的，NF-κB和p38 MAPK兩條信號(hào)通路均參與調(diào)控TLR4介導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-8的表達(dá)。

Fig 2 Effects of TAK-242，SB202190 and PDTC on IL-8 mRNA expression induced by lipopolysaccharide(n=8)

Fig 3 Effects of TAK-242，SB202190 and PDTC on IL-8 protein expression induced by lipopolysaccharide(n=8)

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