崔德鳳，周 波，楊桂梅，李煥榮，阮文科，汪 明，張永紅

(1.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，北京 102206;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 100193)

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類(lèi)能夠發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)，腸球菌(enterococcus)是乳酸菌中對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高、容易培養(yǎng)、分布廣泛的一類(lèi)革蘭氏陽(yáng)性球菌。長(zhǎng)期以來(lái)在乳制品加工、蔬菜及肉制品的發(fā)酵工藝中廣泛應(yīng)用。腸球菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸外，還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌活性的細(xì)菌素，在抑制多種動(dòng)物源病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要作用。Hosnia Abdel－Mohsein等從食品中分離出產(chǎn)生enterocin P細(xì)菌素的腸球菌并對(duì)其特性進(jìn)行了深入的研究［1］。分離自牛糞堆肥中的腸球菌顯示出對(duì)食物源病原微生物和腐敗菌的抑制活性［2］。從牛的胃腸道分離的希氏腸球菌對(duì)李斯特菌屬具有明顯的抑菌活性［3］。還有分離自扁角鹿、雞腸道、鴕鳥(niǎo)腸道、小型豬糞便等動(dòng)物源和分離自青貯飼料、乳酪發(fā)酵劑、西班牙發(fā)酵橄欖、意大利臘腸等食物源腸球菌細(xì)菌素的報(bào)道［4－11］。

細(xì)菌素的合成受到很多因素的影響，其中包括培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、收獲時(shí)間、保存條件等［12］。實(shí)驗(yàn)證明來(lái)源于鵪鶉盲腸的腸球菌產(chǎn)細(xì)菌素活性最強(qiáng)的培養(yǎng)基是ZAL［13］。研究發(fā)現(xiàn)pH和葡萄糖對(duì)Enterococcus faecium P13產(chǎn)生enterocin P的影響，細(xì)菌生長(zhǎng)和葡萄糖消耗在pH 7.0時(shí)達(dá)到最大值，細(xì)菌素的活性呈pH依賴性，pH恒定調(diào)節(jié)為6.0時(shí)，獲得最大抑菌活性［14］。從細(xì)菌素應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)學(xué)角度出發(fā)，研究細(xì)菌素產(chǎn)生菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，細(xì)菌素與產(chǎn)生菌的作用方式，影響細(xì)菌素產(chǎn)量的因素等具有極其重要作用。

產(chǎn)生enterocin E5細(xì)菌素的腸球菌從北京健康商品豬黑六胃腸道分離鑒定［15］，具有廣譜的抑菌活性，編碼enterocins A結(jié)構(gòu)基因。本試驗(yàn)對(duì)影響enterocin E5生產(chǎn)條件，例如培養(yǎng)基組成、pH值、培養(yǎng)溫度等進(jìn)行了全面研究。

1 材料

1.1 菌株 糞腸球菌E5由微生物實(shí)驗(yàn)室分離篩選的產(chǎn)細(xì)菌素菌株;指示菌大腸桿菌K88由微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基:pH 7.0～7.4。其配方為胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、葡萄糖10 g、蔗糖5 g、醋酸鈉 15 g、枸櫞酸銨 2 g、KH2PO46 g、MgSO4·7 H2O 0.58 g、MnSO4·4H2O 0.25 g、FeSO4·7 H2O 0.03 g、吐溫 －80 1 g、蒸餾水1 L。PYG 培養(yǎng)基:pH 6.5。其配方為大豆蛋白胨 0.5 g、酵母浸粉 0.5 g、KH2PO40.1 g、葡萄糖 0.1 g、MgSO4·7 H2O 0.02 g、MnSO4·4 H2O 0.002 g、蒸餾水 0.1 L。

2 方法

2.1 糞腸球菌E5生長(zhǎng)曲線與抑菌活性的測(cè)定將培養(yǎng)12 h糞腸球菌E5種子液以1%的接種量接種于250 mL MRS培養(yǎng)基中，37℃ 培養(yǎng)48 h，每隔2 h取發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)菌密度的測(cè)定，以未接種的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照。采用UN1C0 UV－2000型分光光度計(jì)測(cè)OD600，采用EUTECH pH510型酸度計(jì)測(cè)定pH值。同時(shí)4℃ 10000 r/min離心10 min，取上清采用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定其抑菌圈直徑(mm)，指示菌為大腸桿菌K88。

2.2 培養(yǎng)基及其組分對(duì)enterocin E5產(chǎn)生的影響

接種糞腸球菌 E5種子液于 TSB、SM、MRS和APT四種發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)24 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD600值、pH值及抑菌效價(jià);以有機(jī)氮和無(wú)機(jī)氮(蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，檸檬酸銨、硝酸鈉)代替確定培養(yǎng)基中的氮源成分，以蔗糖、乳糖、阿拉伯糖等常用碳源對(duì)確定培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行等量替換，檢測(cè)發(fā)酵液的OD600值、pH值及抑菌效價(jià);在培養(yǎng)基中添加0.1% ～1%Tween－80，以1%(V/V)種子液進(jìn)行接種，37℃需氧培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌體密度OD600和發(fā)酵上清液的抑菌效果，確定Tween－80的用量。

2.3 培養(yǎng)基起始pH值的確定 用3 mol/L的HCl或3 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的pH值至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，接種腸球菌E5，37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌體生長(zhǎng)密度OD600與細(xì)菌素抑菌活力。

2.4 最適培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式的確定 將接種糞腸球菌 E5 的 MRS 培養(yǎng)基分別在 20、25、30、37、42℃培養(yǎng)24 h，以最適培養(yǎng)溫度選擇振蕩和靜止的方式培養(yǎng)24 h，測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)密度OD600和抑菌效果。

2.5 接種細(xì)菌種齡、接種量的確定 分別將不同種齡(6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h)的糞腸球菌E5種子液按1%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌體密度OD600與抑菌效果。

取最適種齡糞腸球菌E5菌液以1.0% ～10%接種量進(jìn)行接種，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌體密度OD600和上清液的抑菌效果。

3 結(jié)果與分析

3.1 糞腸球菌E5生長(zhǎng)曲線與抑菌活性的測(cè)定結(jié)果如圖1所示。糞腸球菌E5在培養(yǎng)2、3 h即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌濃度呈指數(shù)式的增長(zhǎng)，16～18 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌濃度增長(zhǎng)速度緩慢，發(fā)酵2 h后pH值顯著下降，發(fā)酵22 h后pH值趨于穩(wěn)定，從整個(gè)發(fā)酵過(guò)程可以看出菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，最終pH值為4.5左右。糞腸球菌E5的抑菌活性曲線與細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)走勢(shì)基本相似。細(xì)菌培養(yǎng)2 h可以檢測(cè)到enterocin E5細(xì)菌素，抑菌活性隨培養(yǎng)時(shí)間的變化情況類(lèi)似于菌濃度OD600值的變化，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)菌素開(kāi)始產(chǎn)生，18 h進(jìn)入穩(wěn)定期后細(xì)菌素產(chǎn)量緩慢增加，未觀察到細(xì)菌素產(chǎn)量的減少趨勢(shì)。通常認(rèn)為細(xì)菌素的產(chǎn)生與生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)，有的細(xì)菌素在細(xì)胞開(kāi)始生長(zhǎng)時(shí)即可產(chǎn)生，而有的細(xì)菌素則在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期或穩(wěn)定期產(chǎn)生，在生長(zhǎng)到一定時(shí)間后抑菌活性降低，可能是由于細(xì)菌素吸附到產(chǎn)生菌細(xì)胞表面導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)菌素活性的下降，也可能是細(xì)菌素發(fā)生降解而失活［16］。

圖1 不同時(shí)間下菌體密度與enterocin E5抑菌效果

3.2 細(xì)菌素高產(chǎn)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化 糞腸球菌E5在TSB、SM、MRS和APT四種培養(yǎng)基上均能夠生長(zhǎng)，APT最有利于腸球菌株的菌體生長(zhǎng)，SM產(chǎn)生的菌體濃度最低，細(xì)菌素抑菌活性最小，MRS細(xì)菌素產(chǎn)量最大，其次依次為T(mén)SB、APT和SM，因此選取MRS作為糞腸球菌E5生產(chǎn)細(xì)菌素用培養(yǎng)基。

3.2.1 碳源對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 碳源:分別采用乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖取代MRS中的葡萄糖成分，以1%(m/V)的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始 pH 6.5、37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌體生長(zhǎng)與抑菌圈直徑，結(jié)果如表1所示。

表1 碳源成分對(duì)enterocin E5產(chǎn)量的影響

可以看出除木糖細(xì)菌濃度較低外(因糞腸球菌E5不發(fā)酵木糖)，其他幾種糖均能促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)及細(xì)菌素的產(chǎn)生，培養(yǎng)液pH變化明顯，呈弱酸性，葡萄糖和蔗糖對(duì)細(xì)菌素的形成作用最明顯。

3.2.2 氮源對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 分別用大豆蛋白胨、蛋白胨、檸檬酸銨和硝酸鈉替代MRS中的胰蛋白胨，按1%(m/V)的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始pH 6.5、37℃培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌體生長(zhǎng)與抑菌圈直徑，結(jié)果如表2所示。

表2 氮源成分對(duì)enterocin E5產(chǎn)量的影響

可以看出，胰蛋白胨最有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)及細(xì)菌素的產(chǎn)生，添加蛋白胨、大豆蛋白胨細(xì)菌素產(chǎn)量較低;無(wú)機(jī)氮源不能滿足細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)需要與細(xì)菌素的生成，培養(yǎng)液pH值基本無(wú)變化。有機(jī)氮源的種類(lèi)對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生有較大影響，不同來(lái)源的菌株對(duì)氮源的需要有所不同，細(xì)菌素產(chǎn)量也不盡相同。

3.2.3 Tween－80添加量對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響Tween－80是一種表面活性劑，可以促進(jìn)細(xì)菌素的產(chǎn)生和抑菌活性的增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)表明:當(dāng)Tween－80的添加量為0.1%時(shí)，抑菌圈直徑為1.8 cm，比不添加Tween－80的對(duì)照組(抑菌圈直徑1.62 cm)抑菌活性提高了10%。

3.3 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 結(jié)果如圖2所示，培養(yǎng)基初始pH值對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量有較大影響，在初始pH 6.5時(shí)細(xì)菌素產(chǎn)量最大，偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生。細(xì)胞生長(zhǎng)變化較小，在pH 6.5時(shí)OD600達(dá)到最大值，這也說(shuō)明細(xì)菌素的產(chǎn)生與細(xì)胞生長(zhǎng)呈正相關(guān)。

圖2 初始pH值對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的影晌

3.4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 分別將接種糞腸球菌E5的MRS培養(yǎng)基置于不同的溫度(20、25、30、37、42℃)培養(yǎng)24 h，測(cè)定菌體生長(zhǎng)密度與抑菌圈直徑(表3)。細(xì)菌最低生長(zhǎng)溫度為20℃，最高生長(zhǎng)溫度42℃，隨著溫度的升高，細(xì)菌密度不斷增加，在37℃達(dá)到最大值，細(xì)菌生長(zhǎng)最好，獲得最大細(xì)菌素活性單位。高于37℃，細(xì)菌生長(zhǎng)密度明顯降低，這與資料報(bào)道的某些細(xì)菌素在低于最適培養(yǎng)溫度條件下有較高細(xì)菌素產(chǎn)量的結(jié)論不一致，說(shuō)明細(xì)菌素的產(chǎn)生是一種復(fù)雜生理代謝過(guò)程，與多種因素有關(guān)。糞腸球菌E5在振蕩和靜止情況下都能生長(zhǎng)，2種培養(yǎng)方式的菌體密度和抑菌效果差異不顯著。

表3 培養(yǎng)溫度對(duì)enterocin E5產(chǎn)量的影響

3.5 接種種齡、接種量對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 不同種齡對(duì)菌體密度和細(xì)菌素抑菌效果的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示:種齡10～14 h之間細(xì)菌素產(chǎn)量基本一致，種齡14 h菌體密度最高，抑菌效果最明顯，16 h后菌體密度和發(fā)酵上清液的抑菌效果有降低的趨勢(shì)。

最佳接種量的確定:隨著接種量的改變細(xì)菌素的抑菌效果變化很大，接種量2% ～10%時(shí)菌體密度基本沒(méi)有太大變化，0.5%接種量細(xì)菌生長(zhǎng)較慢，接種量2%時(shí)抑菌效果最好，可能2%接種量有利于細(xì)菌的快速生長(zhǎng)和細(xì)菌素的分泌和積累。

4 討論

細(xì)菌產(chǎn)細(xì)菌素一方面由內(nèi)在的遺傳特性所決定，另一方面還會(huì)受到生長(zhǎng)環(huán)境條件的限制，例如營(yíng)養(yǎng)(包括碳源和氮源)［17］、溫度、初始 pH、生長(zhǎng)刺激因子、培養(yǎng)方式以及其他代謝物都會(huì)影響細(xì)菌素的產(chǎn)量與活性。本實(shí)驗(yàn)采用幾種常用乳酸菌培養(yǎng)基檢測(cè)細(xì)菌素活性，發(fā)現(xiàn)APT最有利于糞腸球菌E5株菌體的生長(zhǎng)，但是MRS最適合細(xì)菌素的產(chǎn)生與積累，因此選取MRS作為糞腸球菌E5細(xì)菌素生產(chǎn)用培養(yǎng)基。

乳酸菌在細(xì)菌生長(zhǎng)的過(guò)程中產(chǎn)生細(xì)菌素，培養(yǎng)條件刺激細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)菌素的合成［18－19］，然而提高生長(zhǎng)率和細(xì)菌菌體濃度對(duì)獲得滿意的細(xì)菌素水平并不是必需的，環(huán)境條件完全可以影響特定細(xì)菌素的產(chǎn)生。即使細(xì)菌素產(chǎn)生菌生長(zhǎng)很好，每個(gè)細(xì)胞合成多少細(xì)菌素，怎樣產(chǎn)生的都不能確定。在這種情況下，培養(yǎng)基的成分、最適pH、培養(yǎng)溫度等條件尤為重要。

為了探討細(xì)菌主要營(yíng)養(yǎng)素碳源和氮源對(duì)菌體生長(zhǎng)、菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響，按MRS培養(yǎng)基的碳源比例分別用蔗糖、乳糖、麥芽糖等常用碳源對(duì)原培養(yǎng)基中的葡萄糖作了等量替換。實(shí)驗(yàn)證明，糞腸球菌E5菌株的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。此結(jié)果與大多數(shù)的細(xì)菌素產(chǎn)生菌的碳源需求相似，可能是因?yàn)槿樗峋哂幸粋€(gè)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和蔗糖的運(yùn)轉(zhuǎn)與伴隨的磷酸化代謝途徑。實(shí)驗(yàn)分別以15 g的有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源代替MRS培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母浸粉總量，結(jié)果表明胰蛋白胨和酵母浸粉最有利于細(xì)菌素的生成。研究表明胰蛋白胨和酵母浸粉對(duì)乳酸乳球菌產(chǎn)生nisin有很大影響，兩種成分都能增加nisin的產(chǎn)量，然而高濃度的胰蛋白胨會(huì)使nisin產(chǎn)量減少［20］。研究發(fā)現(xiàn)增加培養(yǎng)基中有機(jī)氮源的含量可以使微球菌GO5產(chǎn)生的micrococcin GO5產(chǎn)量有很大提高，培養(yǎng)起始pH為7.0～9.0，最適溫度為37℃，在 MRS組成中，乳糖和蔗糖更利于 micrococcin GO5產(chǎn)生［21］。有機(jī)氮源的種類(lèi)對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)量也有影響，這可能與細(xì)菌素合成機(jī)制有關(guān)，某些氮源物質(zhì)成分誘導(dǎo)了細(xì)菌素基因的啟動(dòng)［22］。

Tween－80是一種表面活性劑，作為一種乳化劑，能夠降低細(xì)菌與玻璃器材之間的表面張力，改善細(xì)菌素產(chǎn)生菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)菌素的形成和活力的增強(qiáng)，但Tween－80過(guò)量會(huì)影響硫酸銨反應(yīng)，形成沉淀，使純化難度加大［12］。本實(shí)驗(yàn)比較了添加 Tween－80對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的影響，確定0.1%的Tween－80有利于細(xì)菌素的形成。

各種細(xì)菌素產(chǎn)生的最適溫度各不相同，這與細(xì)菌的種類(lèi)與不同的來(lái)源有關(guān)。乳酸鏈球菌產(chǎn)生Nisin的 最 適 溫 度 為 30℃［20］，而 擴(kuò) 展 短 桿 菌ATCC9175在25℃時(shí)類(lèi)細(xì)菌素的產(chǎn)量最高，37℃細(xì)菌素產(chǎn)量不明顯［22］。乳酸菌 CCUG42687合成Sakacin P最適溫度為20℃，在25℃ ～30℃細(xì)胞濃度低時(shí)，Sakacin P停止形成，培養(yǎng)溫度 20℃時(shí)Sakacin P的產(chǎn)量是30℃時(shí)的7倍，葡萄糖耗盡時(shí)，Sakacin P濃度非常低，酵母粉濃度增加，細(xì)菌細(xì)胞增長(zhǎng)率增加，伴隨Sakacin P產(chǎn)量增加，胰蛋白胨的濃度對(duì)Sakacin P也有正向影響［23］。而腸球菌RZS C5產(chǎn)細(xì)菌素的溫度必須控制在35℃。本實(shí)驗(yàn)中的糞腸球菌E5產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素的最適溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)對(duì)細(xì)菌素產(chǎn)生的影響差異不顯著。糞腸球菌E5在細(xì)菌生長(zhǎng)穩(wěn)定期后獲得最大抑菌活性細(xì)菌素，與大多數(shù)細(xì)菌素產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)相似。

乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素受許多因素制約，培養(yǎng)基起始pH值是影響細(xì)菌素合成的重要因素之一。研究顯示培養(yǎng)基起始pH值能夠影響乳鏈球菌生長(zhǎng)和nicin的生物合成，pH值4.0～4.5時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)較差，pH值4.0時(shí)沒(méi)有觀察到nicin生物合成，培養(yǎng)基最適pH值為4.6～6.6。細(xì)菌素Nisin在pH值偏酸性時(shí)，抑菌活性強(qiáng);在pH值偏中性時(shí)，抑菌效果顯著下降［24］。不同的細(xì)菌素適用的pH范圍不同，大多數(shù)在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，作用效果也較好。但很多細(xì)菌素在中性或堿性條件下，抑菌活性減弱或喪失，如 PediocniAcH、PediocinA、PediocinPA.1、Uctaein、Lactaein27、Acidolin、Nisin 和 Diplococcin 具有相似的特征，此現(xiàn)象可能是由于細(xì)菌素分子在堿性條件下降解造成的。本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基在初始pH 6.5時(shí)細(xì)菌素產(chǎn)量最大，偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生。這一結(jié)果與細(xì)菌素的pH值生物學(xué)耐受性的特性相符［25］。

5 結(jié)論

本文首次報(bào)道從北京優(yōu)良地方品種黑六豬胃腸道分離產(chǎn)enterocin E5糞腸球菌，并確定了最適培養(yǎng)條件為MRS培養(yǎng)基，起始pH值6.5、培養(yǎng)溫度37℃，接種量2%、種齡14 h，發(fā)酵時(shí)間16 h，最佳培養(yǎng)基組分氮源為1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源為1%葡萄糖、0.5%蔗糖，0.1%Tween－80有利于enterocin E5的產(chǎn)生。上述結(jié)論為enterocin E5作為抗菌制劑的研制奠定了理論基礎(chǔ)。

［1］Abdel－ Mohsein H，Yamamoto N，Otawa K，et al.Isolation of Bacteriocin－like Substances Producing Bacteria from Finished Cattle－manure Compost and Activity Evaluation against Some Food －borne Pathogenic and Spoilage Bacteria［J］.J Gen Appl Microbiol，2010，56(2):151 －161.

［2］Aasen I M，Moretro T，Katla T，et al.Influence of Complex Nutrients，Temperature and pH on Bacteriocin Production by Lactobacillus sakei CCUG 42687［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2000，53(2):159－166.

［3］Siragusa G R.Production of Bacteriocin Inhibitory to Listeria Species by Enterococcus hirae［J］.Appl Environ Microbiol，1992，58(11):3508－3513.

［4］Abriouel H，N Ben Omar，R Lucas M，et al.Bacteriocin Production，Plasmid Content and Plasmid Location of Enterocin P Structural Gene in Enterococci Isolated from Food Sources［J］.Lett Appl Microbiol，2006，42(4):331 －337.

［5］Floriano B，Ruiz－ Barba J R，Rufino Jiménez－ Díaz.Purification and Genetic Characterization of Enterocin I from Enterococcus faecium 6T1a，a Novel Antilisterial Plasmid－encoded Bacteriocin Which Does Not Belong to the Pediocin Family of Bacteriocins［J］.Appl Environ Microbiol，1998，64(12):4883 －4890.

［6］Jennes W，Dicks L M，Verwoerd D J.Enterocin 012，A Bacteriocin Produced by Enterococcus gallinarum Isolated from the Intestinal Tract of Ostrich［J］.J Appl Microbiol，2000，88(2):349 －357.

［7］Laukova A.Enterococci and Staphylococci Isolates from Rumen of Fallow Deers and Their Antimicrobial Activity［J］.New Microbiol，1993，16(4):351 － 357.

［8］Laukova A，Czikkova S，Laczkova S，et al.Use of Enterocin CCM 4231 to Control Listeria monocytogenes in Experimentally Contaminated Dry Fermented Hornad Salami［J］.Int J Food Microbiol，1999，52(1/2):115 －119.

［9］Messens W，Verluyten J，Leroy F，et al.Modelling Growth and Bacteriocin Production by Lactobacillus curvatus LTH 1174 in Response to Temperature and pH Values Used for European Sausage Fermentation Processes［J］.Int J Food Microbiol，2003，81(1):41－52.

［10］Villani F，Salzano G，Sorrentino E，et al.Enterocin 226NWC，a Bacteriocin Produced by Enterococcus faecalis 226，Active against Listeria monocytogenes［J］.J Appl Bacteriol，1993，74(4):380－387.

［11］Vlaemynck G，Herman L，Coudijzer K.Isolation and Characterization of Two Bacteriocins Produced by Enterococcus faecium Strains Inhibitory to Listeria monocytogenes［J］.Int J Food Microbiol，1994，24(1/2):211 －225.

［12］Penna T C，Moraes D A.Optimization of Nisin Production by Lactococcus lactis［J］.Appl Biochem Biotechnol，2002，98(100):775－789.

［13］Laukova A.The Effect of Culture Media on Bacteriocin Production in Various Strains of Bacteria［J］.Vet Med(Praha)，1992，37(12):661－666.

［14］Herranz C，Martinez J M，Rodríguez J M，et al.Optimization of Enterocin P Production by Batch Fermentation of Enterococcus faecium P13 at Constant pH［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56(3/4):378 －383.

［15］楊桂梅.豬益生性腸球菌的篩選及其特性研究［D］.北京:北京農(nóng)學(xué)院，2009.

［16］Parente E，Ricciardi A.Production，Recovery and Purification of Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1999，52:628 －638.

［17］Mataragas M，Drosinos E H，Tsakalidou E，et al.Influence of Nutrients on Growth and Bacteriocin Production by Leuconostoc mesenteroides L124 and Lactobacillus curvatus L442［J］.Antonie Van Leeuwenhoek，2004，85(3):191 －198.

［18］De Vuyst L，Leroy F.Bacteriocins from Lactic Acid Bacteria:Production，Purification，and Food Applications［J］.J Mol Microbiol Biotechnol，2007，13(4):194 －199.

［19］Leroy F，De Vuyst L.Temperature and pH Conditions That Prevail during Fermentation of Sausages Are Optimal for Production of the Antilisterial Bacteriocin Sakacin K［J］.Appl Environ Microbiol，1999，65(3):974 －981.

［20］Cabo M L，Murado M A，Gonzalez M P，et al.An Empirical Model for Describing the Effects of Nitrogen Sources on Nisin Production［J］.Lett Appl Microbiol，2001，33(6):425 －429.

［21］Kim M H，Kong Y J，Baek H，et al.Optimization of Culture Conditions and Medium Composition for the Production of Micrococcin GO5 by Micrococcus sp.GO5［J］.J Biotechnol，2006，121(1):54－61.

［22］Verluyten J，Leroy F，De Vuyst L.Influence of Complex Nutrient Source on Growth of and Curvacin a Production by Sausage Isolate Lactobacillus curvatus LTH 1174［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70(9):5081 －5088.

［23］Audisio M C，Oliver G，Apella M C.Antagonistic Effect of Enterococcus faecium J96 against Human and Poultry Pathogenic Salmonella spp［J］.J Food Prot，1999，62(7):751 －755.

［24］Egorov N S，Baranova I P，Grushina V A.Effect of the Initial pH Value of the Medium on the Growth of Streptococcus lactis and the Biosynthesis of Nisin［J］.Antibiotiki，1976，21(6):499 － 501.

［25］Simova E D，Beshkova D B，Dimitrov Zh P.Characterization and Antimicrobial Spectrum of Bacteriocins Produced by Lactic Acid Bacteria Isolated From Traditional Bulgarian Dairy Products［J］.J Appl Microbiol，2009，106(2):692 －701.