王小敏 彭偉 凌學(xué)民 王小燕

廣東省深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518112

塞來昔布對宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡及環(huán)氧合酶-2表達的影響

王小敏 彭偉 凌學(xué)民 王小燕

廣東省深圳市龍崗區(qū)第二人民醫(yī)院婦科，廣東 深圳 518112

背景與目的：環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎剡^程中的關(guān)鍵酶，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用，近年來其被證實與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后關(guān)系密切。塞來昔布作為一種選擇性COX-2抑制劑，在腫瘤的預(yù)防和治療中已顯示其優(yōu)越性和廣闊前景。本研究通過觀察塞來昔布對宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡和COX-2表達的影響，探討塞來昔布抗腫瘤的作用機制。方法：體外培養(yǎng)宮頸癌HeLa細(xì)胞，以倒置相差顯微鏡觀察不同濃度塞來昔布作用不同時間下的HeLa細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；DAPI熒光化學(xué)法及DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測COX-2蛋白的表達。結(jié)果：HeLa細(xì)胞經(jīng)塞來昔布處理后生長相對緩慢，出現(xiàn)典型細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，并隨藥物濃度增加及作用時間延長而顯著改變。塞來昔布能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，凋亡率隨藥物濃度增加而逐漸增高(F＝46.810，P=0.002)，DNA梯形條帶明顯，并呈濃度依賴性。塞來昔布呈時間及藥物濃度依賴式降低COX-2蛋白的表達。結(jié)論：塞來昔布在體外通過抑制COX-2表達，誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

塞來昔布； 宮頸癌HeLa細(xì)胞； 環(huán)氧合酶-2； 細(xì)胞凋亡

環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎剡^程中的關(guān)鍵酶，在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要調(diào)控作用。近年來COX-2被證實在宮頸癌中過表達，與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后關(guān)系密切［1-4］。目前，流行病學(xué)、動物實驗和臨床治療等多方面資料均表明，選擇性COX-2抑制劑能預(yù)防或逆轉(zhuǎn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［5］。塞來昔布是最早通過美國FDA驗證的一種選擇性COX-2抑制劑，其藥理學(xué)特點是選擇性抑制COX-2表達，安全性高且療效好，對腫瘤細(xì)胞的抑制作用明顯強于其他COX-2抑制劑［6］。因此，本研究擬分析塞來昔布對體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響，探討其在宮頸癌新輔助化療中的作用，為治療宮頸癌提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購于中山大學(xué)動物實驗中心。培養(yǎng)基H-DMEM購自Gibco公司。胎牛血清購自杭州四季青生物公司。胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、DAPI購自Sigma公司。塞來昔布購自Pfizer Pharmaceuticals公司，并溶于DMSO中，存于4 ℃?zhèn)溆谩嶒炛蠨MSO終濃度≤0.1%，預(yù)實驗結(jié)果顯示對HeLa細(xì)胞生長無影響。所有實驗均在中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心完成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌HeLa細(xì)胞，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素的DMED培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度的條件下培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁生長，0.25%胰酶消化傳代，2～3 d更換培養(yǎng)液，取對數(shù)生長期細(xì)胞實驗。

1.2.2 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)HeLa細(xì)胞加不同濃度(10、20、40、80、120和160 μmol/L)塞來昔布，作用不同時間(24、48、72和96 h)，用倒置相差顯微鏡逐日觀察細(xì)胞生長、凋亡情況。

1.2.3 DAPI熒光法檢測細(xì)胞凋亡 按照以下步驟進行：HeLa細(xì)胞以每孔1×104/mL傳代至24孔板中培養(yǎng)，饑餓同步化處理后，加入10、20、40、80 μmol/L塞來昔布作用24 h；收集漂浮及胰酶消化的貼壁細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)基，PBS洗滌；加入1‰ DAPI(4,6-Diamidino-2-phenylindole，4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色液室溫作用15 min，棄去染色液，PBS洗滌；緩沖甘油封片，Leca熒光顯微鏡下以340/380 nm紫外光激發(fā)，觀察、拍照。每濃度組在高倍鏡下取5個互不重疊的視野，分別計數(shù)凋亡細(xì)胞所占百分率。

1.2.4 DNA Ladder檢測細(xì)胞凋亡 取復(fù)蘇后傳代至第2～3代細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長到70%～80%時換無血清DMEM培養(yǎng)24 h，分別加入塞來昔布10、20、40、80 μmol/L作用24 h；收集漂浮和貼壁的細(xì)胞至離心管中，1 098×g離心5 min，棄上清液。PBS重懸后，以1 098×g離心5 min，棄上清液。用1 mL PBS重懸后轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，4 390×g離心5 min，棄上清液。加入500 μL lysis緩沖液，用槍頭反復(fù)輕柔吹打混勻，常溫作用15 min。常溫16 060×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的EP管中，加入蛋白K(100 μg/mL)，55 ℃水浴30 min。加入750 μL 無水乙醇和125 μL濃度為5 mol/L的氯化鈉溶液于-20 ℃顛倒混勻過夜。取出樣品，4 ℃16 060×g離心15 min，棄上清液加入500 μL 1× TE緩沖液溶解沉淀。加入500 μL酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)混合液，常溫靜置15 min。常溫16 060×g離心15 min。轉(zhuǎn)移上層液體至新的EP管中，加入500 μL氯仿劇烈振搖15 s，常溫作用15 min。常溫16 060×g離心15 min。轉(zhuǎn)移上層液體至新的EP管中，加入750 μL 無水乙醇和125 μL氯化鈉溶液(5 mol/L)-20 ℃過夜。取出樣品，4 ℃16 060×g離心15 min，棄上清液。加入適量1×TE緩沖液(30 μL)溶解(-20 ℃過夜)。1.5%瓊脂糖電泳，紫外燈下觀察拍照。正常細(xì)胞DNA鏈完整，在加樣孔附近出現(xiàn)粗條帶，而凋亡細(xì)胞DNA鏈以核小體為單位被切割降解，在凝膠泳道呈現(xiàn)180～200 bp為間隔的梯狀DNA電泳圖譜(DNA ladder)。

1.2.5 Western blot檢測COX-2蛋白表達 取復(fù)蘇后傳代至第2～3代細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長到70%～80%時換無血清DMEM培養(yǎng)24 h。以β-actin作為內(nèi)參照。塞來昔布時-效關(guān)系組分別給予塞來昔布40 μmol/L，分別在0、0.5、1、6和12 h時收取細(xì)胞；量-效關(guān)系組分別給予塞來昔布0、l0、20、40 μmol/L，20%胎牛血清為陽性對照，12 h收取細(xì)胞蛋白。分離膠濃度為12%，每個加樣孔的蛋白上樣量為100 μg。電泳時，電流強度為40 mA 120 min。電泳后制“三明治”以400 mA轉(zhuǎn)膜3 h。5%TBS脫脂奶粉封閉液封閉30 min，TBS液清洗1次，每次5 min； 一抗溫育4 ℃冰箱搖床過夜(COX-2一抗按1∶500稀釋)，第2天倒出一抗，TBS清洗1次，每次5 min；二抗室溫作用120 min(二抗按l∶5 000稀釋)，TBS清洗4次，每次5 min，其中第2次加入0.1%TWEEN-20洗膜。顯色：ECL化學(xué)顯色試劑盒(A液∶B液=1∶1)，于暗房中顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，應(yīng)用SPSS 10.0軟件，采用方差分析，并用SNK法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

HeLa細(xì)胞貼壁生長良好，呈梭形或三角形，細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，有核仁，生長力旺盛，細(xì)胞間連接緊密，在普通光鏡下透明度強(圖1A)。經(jīng)塞來昔布處理后的細(xì)胞相對增長緩慢，細(xì)胞生長狀態(tài)較差，可見到明顯的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞核濃縮，貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落呈懸浮狀(圖1B-D)，隨藥物濃度增加及作用時間延長，細(xì)胞受到的影響增加。20 μmol/L塞來昔布處理HeLa細(xì)胞12 h，見少量細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增寬，底色模糊(圖1B)，24 h后細(xì)胞體積變小、變形，胞質(zhì)顆粒增多，見空泡，胞核濃縮，少許漂浮細(xì)胞(圖1C)。160 μmol/L塞來昔布處理HeLa細(xì)胞24 h，大部分貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落呈懸浮狀，存活細(xì)胞減少，出現(xiàn)大量細(xì)胞碎片(圖1D)。

2.2 DAPI免疫熒光法檢測細(xì)胞凋亡

正?；罴?xì)胞產(chǎn)生較弱的藍色熒光，核形態(tài)呈圓形，邊緣清晰，染色均勻(圖2A)。凋亡細(xì)胞產(chǎn)生很強的藍光染色，細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，體積縮小，染色質(zhì)濃集，著色較重，并伴有細(xì)胞核固縮，核小體碎片增加，圖2B為20 mol/L塞來昔布作用24 h后典型的HeLa細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，提示塞來昔布能誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。

對照組HeLa細(xì)胞凋亡率為(3.0±1.3)%，隨塞來昔布濃度增加，細(xì)胞凋亡趨于明顯，呈濃度依賴性：以10、20、40和80 μmol/L處理24 h后，HeLa細(xì)胞凋亡率分別為(10.2±0.8)%、(24.5±1.8)%、(53.3±2.6)%和(76.1±3.2)%，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=46.810，P=0.002)，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.3 DNA 梯度檢測塞來昔布對HeLa細(xì)胞凋亡的影響

HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度塞來昔布處理24 h后，分離提純DNA進行瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙啶染色(圖3)，觀察到典型的DNA 梯度，表明塞來昔布能誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。當(dāng)塞來昔布濃度＞20 μmol/L時，隨藥物濃度增加，DNA 梯度明顯增加，說明其作用存在濃度依賴性。

2.4 塞來昔布對HeLa細(xì)胞COX-2蛋白表達的影響

0、10、20和40 μmol/L塞來昔布作用12 h后，COX-2蛋白的表達隨著藥物濃度增加而減弱，呈濃度依賴性(圖4)。40 μmol／L塞來昔布作用HeLa細(xì)胞0.5、1、6和12 h后，COX-2蛋白表達隨藥物作用時間延長而減弱，呈時間依賴性(圖5)。

3 討 論

COX-2是一種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的酶，在正常組織中無表達，在炎癥、腫瘤等病理誘導(dǎo)條件下高表達。近年研究證實，COX-2在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。COX-2過表達能促進癌細(xì)胞增殖，抑制宮頸癌浸潤部位腫瘤細(xì)胞凋亡，增強腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，參與腫瘤新生血管形成等諸多過程，與腫瘤轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)有關(guān)，可作為反映宮頸癌生物學(xué)行為的有效指標(biāo)［1-2，7］。同時，COX-2是接受新輔助化療、手術(shù)，以及放、化療宮頸癌患者治療反應(yīng)差、預(yù)后不良的獨立因素和主要決定指標(biāo)［3-4］。目前，通過抑制COX-2表達治療宮頸癌成為眾多學(xué)者研究的熱點。

塞來昔布是新一代高效選擇性COX-2抑制劑，口服耐受性好，幾乎沒有胃腸道反應(yīng)和腎毒性［8］，已被美國FDA批準(zhǔn)用于預(yù)防家族性腸息肉病的惡變。據(jù)報道，塞來昔布及其衍生物能夠抑制結(jié)腸癌、前列腺癌、肝癌和頭頸部腫瘤等多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療中已顯示出優(yōu)越性和廣闊前景［8］。因此，本研究以塞來昔布對體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響作為研究內(nèi)容。

本研究在倒置相差顯微鏡下觀察到，HeLa細(xì)胞經(jīng)塞來昔布處理后出現(xiàn)了凋亡，在凋亡細(xì)胞中可見核濃縮等典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化。本研究進一步采用了DAPI熒光染色法，該方法能較準(zhǔn)確地區(qū)別細(xì)胞凋亡和壞死、計量細(xì)胞凋亡率。DAPI染料對細(xì)胞膜有半通透性，可透過正常活細(xì)胞產(chǎn)生較弱的藍色熒光，而凋亡細(xì)胞的膜通透性增加，對其攝取能力增強，產(chǎn)生很強的藍光染色。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核邊緣不規(guī)則，細(xì)胞核染色體濃集、著色較重，并伴有核固縮、核小體碎片增加；而正常細(xì)胞的核形態(tài)呈圓形，邊緣清晰、染色均勻，因此從熒光強度及核形態(tài)均可鑒別細(xì)胞發(fā)生凋亡的典型特征。在熒光顯微鏡下觀察到，塞來昔布組HeLa細(xì)胞出現(xiàn)了大量凋亡現(xiàn)象，在凋亡的細(xì)胞中可見染色質(zhì)凝聚 、核固縮、凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)學(xué)變化，這可能是細(xì)胞內(nèi)DNA發(fā)生斷裂的結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，塞來昔布處理組出現(xiàn)典型的DNA梯度，表明塞來昔布能誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡。同時本研究中還觀察到，一定范圍內(nèi)，隨著塞來昔布濃度增高，宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡越明顯，即呈濃度依賴性，提示塞來昔布在宮頸癌臨床治療中具有一定潛在價值，有希望成為新型有效的宮頸癌化療藥物。

在不同的腫瘤細(xì)胞中，塞來昔布誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機制可能存在差異，包括COX-2途徑和非COX-2途徑。本研究發(fā)現(xiàn)，塞來昔布作用于HeLa細(xì)胞，COX-2蛋白表達迅速降低，而細(xì)胞凋亡呈上升趨勢，且這種作用呈藥物濃度和時間依賴性，表明塞來昔布依賴COX-2途徑誘導(dǎo)凋亡是可能的。然而研究中觀察到塞來昔布誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用并非完全與COX-2表達呈正比，提示非COX-2依賴性途徑的存在。Fukada等［9］發(fā)現(xiàn)塞來昔布可通過抑制Survivin表達誘導(dǎo)凋亡；此外，Kim等［10］認(rèn)為生長抑制及DNA損傷誘導(dǎo)基因GADD153，通過上調(diào)促凋亡蛋白如Bak的表達，在塞來昔布誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用?？梢娙麃砦舨伎鼓[瘤的作用機制是多層面的，尚有待進一步研究。李新國［11］等研究發(fā)現(xiàn)，選擇性COX-2抑制劑NS-398通過改變細(xì)胞周期對宮頸癌細(xì)胞的增殖也具有抑制作用，提示同類藥可能有不同的作用機制，為宮頸癌的化療提供了新的思路。

致謝 衷心感謝中山大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗教學(xué)中心的黃錦桃老師在本實驗過程中給予大力支持和幫助！

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Effects of celecoxib on apoptosis and COX-2 expression in human cervical cancer HeLa cell line

WANG Xiao-min,PENG Wei,LING Xue-min,WANG Xiao-yan(Department of Gynecology,The Second People’s Hospital of Longgang District, Shenzhen Guangdong 518112,China)

WANG Xiao-min E-mail：szwxm73@163.com

Background and purpose：Cyclooxygenase-2 (COX-2), which is the key enzyme in the process of catalyzing arachidonic acid into prostaglandins, plays an important role in the progression of many malignant tumors and has also been confirmed to be relevant to the carcinogenesis, development, metastasis, recurrence and prognosis of cervical cancer. Celecoxib, a COX-2 selective inhibitor, has shown superiority and broad prospects in the chemoprevention and treatment of cancer. In this study, we investigated the effects of celecoxib on apoptosis and COX-2 expression in human cervical cancer HeLa cell line.Methods：HeLa cells were treated by celecoxib using various concentrations for different lengths of time. An inverted photo contrast microscope was used to observe the morphological change of HeLa cells treated with celecoxib. Cell apoptosis was examined using DAPI fluorescence cytochemistry and DNA agarose gel electrophoresis. The expression of COX-2 protein of HeLa cells was detected using the Western Blot method.Results：HeLa cells grew slowly, showing typical apoptosis morphology with increased the concentration and treatment time of celecoxib. DAPI staining indicated that celecoxib could induce apoptosis. The apoptosis rates gradually increased with increased concentrations of celecoxib (F=46.810,P=0.002). DNA agarose gel electrophoresis showed typical DNA ladder in a dose-dependent manner when treated with celecoxib. Western blot showed that celecoxib decreased the expression of COX-2 in a time- and dose- dependent manner.Conclusion：Celecoxib may induce apoptosis of the HeLa cell line by inhibiting the expression of COX-2.

Celecoxib; Cervical cancer HeLa cell; Cyclooxygenase-2; Apoptosis

10.3969/j.issn.1007-3969.2011.02.006

R737.33；R73-36+1

A

1007-3639(2011)02-0110-05

深圳市科技計劃資助項目(No:200602074)。

王小敏 E-mail:szwxm73@163.com

2010-08-25

2010-10-23）